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肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，近十年来，在肺癌化疗、靶向治疗和个体化治疗等方面虽然都取得了很大的进展，但肺癌患者的5年生存率仍然仅有15%，其作用机理复杂，至今尚未完全阐明。因此，如何有效地抑制或阻断肺癌的发生发展是治疗肺癌的关键。深入研究参与肺癌细胞生长与转移的相关分子及其信号转导通路，阐明其中的主要环节，不仅可为肺癌的预防、诊断及治疗提供理论依据，还能为肺癌的早期干预和个体化治疗提供临床指导。
蛋白质精氨酸甲基化修饰通过调控信号通路转导、DNA转录、RNA剪切、核糖体合成、DNA损伤与修复、细胞周期及高尔基体修复等过程，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡以及肿瘤形成等细胞进程。蛋白质精氨酸甲基转移酶5(Protein arginine methyltransferase 5, PRMT5)作为Ⅱ类蛋白质精氨酸甲基转移酶的一种，在肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、淋巴瘤等多种肿瘤中呈高表达，这提示PRMT5在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。然而，PRMT5高表达在肺癌发生发展中的具体功能及其作用机理，目前尚未阐明。本课题在分析肺癌患者组织标本中RMT5的表达与患者生存期之间的关系基础上，进一步通过体外及体内实验探讨PRMT5促进肺癌发生发展的生物学功能和分子机制。
【目的】
1.明确PRMT5在肺癌细胞和组织中的表达情况，及其表达水平与患者临床病例特征(如病理类型、TNM分期、淋巴结转移)之间的相关性，探讨PRMT5作为判断肺癌不良预后的新型肿瘤标志物的临床应用价值。
2.阐明PRMT5异常表达对肺癌细胞增殖与生长、侵袭与转移的调控作用。
3.揭示PRMT5促进肺癌细胞增殖与生长、侵袭和转移的分子机制。
【方法】
1.分别收集两组唐都医院胸外科手术切除的肺癌组织标本：第一组标本包括85例肺癌组织及对应正常肺组织、12例转移淋巴结组织及16例未转移淋巴结组织；第二组标本包括209例肺癌组织及其对应正常肺组织，制作成组织芯片。
2.TCGA数据库分析PRMT5mRNA在NSCLC的表达情况及其与患者肿瘤TNM分期的相关性。使用Kaplan-Meierplotter数据库分析NSCLC患者肿瘤组织PRMT5mRNA表达水平与患者OS及PFS的相互关系。
3.采用Westernblot及IHC分别检测两组组织标本中PRMT5和FGFR3蛋白的表达情况，分析PRMT5表达与FGFR3、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移情况及患者生存期的相关性。
4.构建PRMT5过表达载体、PRMT5shRNA载体和相应的对照载体，包装慢病毒并感染细胞，筛选获得PRMT5上调/下调的稳定感染株细胞。采用Westernblot、qRT-PCR、平板克隆、MTT、划痕实验和Transwell等实验，研究过表达和下调PRMT5对肺癌细胞增殖与生长、侵袭和转移的影响。
5.采用BALB/C裸鼠皮下荷瘤模型和C57BL/6小鼠尾静脉注射肺转移动物模型，结合小动物活体成像的方法，观察和评价PRMT5过表达对肺癌细胞体内成瘤、肺癌转移及小鼠生存期的影响。
6.在PRMT5上调的细胞中利用FGFR3抑制剂(AZD4547和BGJ398)抑制FGFR3活性，在PRMT5下调的细胞中感染FGFR3过表达慢病毒上调FGFR3表达，采用Westernblot、平板克隆、MTT、Transwell实验证实PRMT5通过FGFR3促进肺癌细胞的生长与转移。
7.应用Westernblot、qRT-PCR、双荧光素酶报告基因、CHIP、平板克隆、MTT、Transwell等实验分析上调和下调PRMT5对miR-99家族(miR-99a、miR-99b、miR-100)、FGFR3、Erk及Akt等信号分子表达的影响；分析PRMT5对miR-99家族启动子区域组蛋白(H4R3)的甲基化作用；分析miR-99家族与FGFR33’-UTR的相互结合作用，探讨PRMT5促进肺癌细胞生长与转移的分子机制。
【结果】
1.在mRNA水平及蛋白水平，PRMT5在肺癌组织的表达均显著高于其在正常肺组织的表达，PRMT5在肺癌组织的表达水平与患者肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移及不良预后呈正相关。
2.Westernblot及IHC分别检测分析两组肺癌组织标本中PRMT5和FGFR3蛋白的表达情况，结果显示在肺癌组织中PRMT5蛋白的表达水平与FGFR3表达呈正相关。
3.利用PRMT5过表达慢病毒和PRMT5shRNA慢病毒上调/下调PRMT5表达可促进/抑制肺癌细胞A549和H1299的增殖、迁移与侵袭能力。
4.利用PRMT5过表达慢病毒上调PRMT5在肺癌细胞的表达，可显著提高A549细胞在BALB/C裸鼠体内的成瘤能力，可明显增加LLC细胞在C57BL/6小鼠体内的转移能力，缩短C57BL/6小鼠的生存时间。
5.在肺癌细胞A549和H1299中，上调/下调PRMT5表达可显著增加/降低FGFR3及其下游MAPK信号通路分子Erk和kt的表达及其磷酸化水平。在过表达PRMT5的肺癌细胞中使用FGFR3抑制剂(AZD4547和BGJ398)抑制FGFR3的磷酸化活性，在下调PRMT5的肺癌细胞使用FGFR3过表达慢病毒上调FGFR3表达，二者均可完全或部分逆转由上调/下调PRMT5表达所致的pErk和pAkt表达变化，同时可恢复由上调/下调PRMT5表达所引起的细胞增殖、侵袭与迁移能力的变化。
6.在肺癌细胞A549和H1299中，上调/下调PRMT5可抑制/促进miR-99家族的表达。miR-99家族可直接结合到FGFR3的3’-UTR区并抑制其表达，进而影响下游Erk和Akt的磷酸化活性。
7.CHIP实验结果显示PRMT5可通过组蛋白H4R3对称性二甲基化修饰(H4R3me2s)抑制miR-99家族的表达，而上调miR-99家族的表达可抑制肺癌细胞生长、侵袭和迁移。
【结论】
1.PRMT5在肺癌组织呈高表达，其表达水平与患者肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移及不良预后呈正相关。
2.上调/下调PRMT5表达可促进/抑制肺癌细胞的增殖与生长、侵袭和转移。
3.PRMT5通过对称性二甲基化miR-99家族启动子区域的组蛋白H4R3，抑制miR-99家族的转录。
4.miR-99家族可直接结合到FGFR3的3-UTR区并抑制其转录。过表达miR-99家族将引起FGFR3表达减少，降低Erk和Akt的磷酸化活性，进而调控肺癌细胞的增殖与生长、侵袭与转移。
综合以上研究结论，我们首次发现：①PRMT5通过对称性二甲基化修饰miR-99家族启动子区域的组蛋白H4R3(H4R3me2s)，抑制miR-99家族转录；②miR-99家族可直接结合到FGFR3的3’-UTR区并抑制其表达。因此，PRMT5抑制miR-99家族的转录将导致FGFR3及其下游分子(Erk和Akt)表达上调和磷酸化活性增高；③PRMT5促进肺癌细胞的增殖与生长、侵袭和转移；④PRMT5促进肺癌生长与转移的作用是通过miR-99家族/FGFR3信号通路介导的。
本研究分别从生物学功能及分子机制上证实了PRMT5通过调控miR-99家族/FGFR3信号通路影响肺癌的发生发展。从生物学功能角度丰富了PRMT5对肺癌进展的调节方式，从表观遗传学角度揭示了PRMT5促进肺癌发生发展的分子生物学机制。有望为肺癌的临床防治提供新型分子标志物及潜在治疗靶点，并有助于开发出以PRMT5为靶标、可用于临床有效防治肺癌的候选药物。
蛋白质精氨酸甲基化修饰通过调控信号通路转导、DNA转录、RNA剪切、核糖体合成、DNA损伤与修复、细胞周期及高尔基体修复等过程，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡以及肿瘤形成等细胞进程。蛋白质精氨酸甲基转移酶5(Protein arginine methyltransferase 5, PRMT5)作为Ⅱ类蛋白质精氨酸甲基转移酶的一种，在肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、淋巴瘤等多种肿瘤中呈高表达，这提示PRMT5在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。然而，PRMT5高表达在肺癌发生发展中的具体功能及其作用机理，目前尚未阐明。本课题在分析肺癌患者组织标本中RMT5的表达与患者生存期之间的关系基础上，进一步通过体外及体内实验探讨PRMT5促进肺癌发生发展的生物学功能和分子机制。
【目的】
1.明确PRMT5在肺癌细胞和组织中的表达情况，及其表达水平与患者临床病例特征(如病理类型、TNM分期、淋巴结转移)之间的相关性，探讨PRMT5作为判断肺癌不良预后的新型肿瘤标志物的临床应用价值。
2.阐明PRMT5异常表达对肺癌细胞增殖与生长、侵袭与转移的调控作用。
3.揭示PRMT5促进肺癌细胞增殖与生长、侵袭和转移的分子机制。
【方法】
1.分别收集两组唐都医院胸外科手术切除的肺癌组织标本：第一组标本包括85例肺癌组织及对应正常肺组织、12例转移淋巴结组织及16例未转移淋巴结组织；第二组标本包括209例肺癌组织及其对应正常肺组织，制作成组织芯片。
2.TCGA数据库分析PRMT5mRNA在NSCLC的表达情况及其与患者肿瘤TNM分期的相关性。使用Kaplan-Meierplotter数据库分析NSCLC患者肿瘤组织PRMT5mRNA表达水平与患者OS及PFS的相互关系。
3.采用Westernblot及IHC分别检测两组组织标本中PRMT5和FGFR3蛋白的表达情况，分析PRMT5表达与FGFR3、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移情况及患者生存期的相关性。
4.构建PRMT5过表达载体、PRMT5shRNA载体和相应的对照载体，包装慢病毒并感染细胞，筛选获得PRMT5上调/下调的稳定感染株细胞。采用Westernblot、qRT-PCR、平板克隆、MTT、划痕实验和Transwell等实验，研究过表达和下调PRMT5对肺癌细胞增殖与生长、侵袭和转移的影响。
5.采用BALB/C裸鼠皮下荷瘤模型和C57BL/6小鼠尾静脉注射肺转移动物模型，结合小动物活体成像的方法，观察和评价PRMT5过表达对肺癌细胞体内成瘤、肺癌转移及小鼠生存期的影响。
6.在PRMT5上调的细胞中利用FGFR3抑制剂(AZD4547和BGJ398)抑制FGFR3活性，在PRMT5下调的细胞中感染FGFR3过表达慢病毒上调FGFR3表达，采用Westernblot、平板克隆、MTT、Transwell实验证实PRMT5通过FGFR3促进肺癌细胞的生长与转移。
7.应用Westernblot、qRT-PCR、双荧光素酶报告基因、CHIP、平板克隆、MTT、Transwell等实验分析上调和下调PRMT5对miR-99家族(miR-99a、miR-99b、miR-100)、FGFR3、Erk及Akt等信号分子表达的影响；分析PRMT5对miR-99家族启动子区域组蛋白(H4R3)的甲基化作用；分析miR-99家族与FGFR33’-UTR的相互结合作用，探讨PRMT5促进肺癌细胞生长与转移的分子机制。
【结果】
1.在mRNA水平及蛋白水平，PRMT5在肺癌组织的表达均显著高于其在正常肺组织的表达，PRMT5在肺癌组织的表达水平与患者肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移及不良预后呈正相关。
2.Westernblot及IHC分别检测分析两组肺癌组织标本中PRMT5和FGFR3蛋白的表达情况，结果显示在肺癌组织中PRMT5蛋白的表达水平与FGFR3表达呈正相关。
3.利用PRMT5过表达慢病毒和PRMT5shRNA慢病毒上调/下调PRMT5表达可促进/抑制肺癌细胞A549和H1299的增殖、迁移与侵袭能力。
4.利用PRMT5过表达慢病毒上调PRMT5在肺癌细胞的表达，可显著提高A549细胞在BALB/C裸鼠体内的成瘤能力，可明显增加LLC细胞在C57BL/6小鼠体内的转移能力，缩短C57BL/6小鼠的生存时间。
5.在肺癌细胞A549和H1299中，上调/下调PRMT5表达可显著增加/降低FGFR3及其下游MAPK信号通路分子Erk和kt的表达及其磷酸化水平。在过表达PRMT5的肺癌细胞中使用FGFR3抑制剂(AZD4547和BGJ398)抑制FGFR3的磷酸化活性，在下调PRMT5的肺癌细胞使用FGFR3过表达慢病毒上调FGFR3表达，二者均可完全或部分逆转由上调/下调PRMT5表达所致的pErk和pAkt表达变化，同时可恢复由上调/下调PRMT5表达所引起的细胞增殖、侵袭与迁移能力的变化。
6.在肺癌细胞A549和H1299中，上调/下调PRMT5可抑制/促进miR-99家族的表达。miR-99家族可直接结合到FGFR3的3’-UTR区并抑制其表达，进而影响下游Erk和Akt的磷酸化活性。
7.CHIP实验结果显示PRMT5可通过组蛋白H4R3对称性二甲基化修饰(H4R3me2s)抑制miR-99家族的表达，而上调miR-99家族的表达可抑制肺癌细胞生长、侵袭和迁移。
【结论】
1.PRMT5在肺癌组织呈高表达，其表达水平与患者肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移及不良预后呈正相关。
2.上调/下调PRMT5表达可促进/抑制肺癌细胞的增殖与生长、侵袭和转移。
3.PRMT5通过对称性二甲基化miR-99家族启动子区域的组蛋白H4R3，抑制miR-99家族的转录。
4.miR-99家族可直接结合到FGFR3的3-UTR区并抑制其转录。过表达miR-99家族将引起FGFR3表达减少，降低Erk和Akt的磷酸化活性，进而调控肺癌细胞的增殖与生长、侵袭与转移。
综合以上研究结论，我们首次发现：①PRMT5通过对称性二甲基化修饰miR-99家族启动子区域的组蛋白H4R3(H4R3me2s)，抑制miR-99家族转录；②miR-99家族可直接结合到FGFR3的3’-UTR区并抑制其表达。因此，PRMT5抑制miR-99家族的转录将导致FGFR3及其下游分子(Erk和Akt)表达上调和磷酸化活性增高；③PRMT5促进肺癌细胞的增殖与生长、侵袭和转移；④PRMT5促进肺癌生长与转移的作用是通过miR-99家族/FGFR3信号通路介导的。
本研究分别从生物学功能及分子机制上证实了PRMT5通过调控miR-99家族/FGFR3信号通路影响肺癌的发生发展。从生物学功能角度丰富了PRMT5对肺癌进展的调节方式，从表观遗传学角度揭示了PRMT5促进肺癌发生发展的分子生物学机制。有望为肺癌的临床防治提供新型分子标志物及潜在治疗靶点，并有助于开发出以PRMT5为靶标、可用于临床有效防治肺癌的候选药物。