论文部分内容阅读
原发性肝癌位于恶性肿瘤死亡率前列,具有发病率高,不易发现,病情发展迅速等特点,是现代分子细胞生物学,医学的研究热点。KDM5C(JARID1C or SMCX)属于组蛋白去甲基化酶家族,位于X染色体,含有一个ARID结构域,一个JmjC结构域,一个JmjN结构域和两个PHD型锌指的蛋白质,其中JmjC结构域主要发挥特异性去除H3K4me3的甲基残基的功能,而H3K4me3是一个重要的组蛋白修饰marker,可以影响其他基因的转录激活。本课题通过实时定量PCR检测了KDM5C在人肝癌及癌旁组织的表达,结果显示相对于癌旁组织,KDM5C在肝癌组织中的表达上调。苏木精伊红(HE)染色和免疫组化的结果显示,KDM5C基因在肝癌组织的细胞核和细胞质中均有表达,但主要集中于细胞核内。为研究KDM5C在肝癌细胞中的功能,本文利用CRISPR/Cas9对KDM5C进行了敲除并建立了稳定的细胞系。首先利用CRISPR/Cas9的靶点设计网站进行KDM5C敲除位点的设计选择,随后将构建好的靶点连入pX458载体,转染肝癌HepG2细胞,利用有限稀释法建立KDM5C敲除细胞系(KDM5C-KO)并通过测序和Western Blot进行了敲除验证。其次本论文研究了KDM5C对肝癌细胞生物学行为的影响。MTT增殖和克隆形成实验的结果显示,KDM5C敲除显著抑制了肝癌细胞HepG2的增殖和克隆形成;PI染色发现KDM5C敲除后,细胞S期比例下降,细胞增殖受到抑制;进一步研究发现KDM5C敲除促进了肝癌细胞的凋亡;细胞划痕和Transwell小室实验结果表明KDM5C敲除显著抑制了细胞迁移侵袭能力。综上所述,本研究分析了KDM5C在肝癌中的表达及定位,通过CRISPR/Cas9进行KDM5C敲除并建立了稳转敲除细胞系。KDM5C基因敲除显著抑制了肝癌细胞增殖,迁移,侵袭,克隆形成,以上结果表明KDM5C通过促进肿瘤的发生在肝癌细胞中发挥功能。