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猪瘟(Classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起猪的一种高度接触性,致死性的传染病,是养猪业面临的最大的威胁之一,也是制约我国养猪业发展的最重要的疫病之一。世界动物卫生组织(OIE)将其列入OIE疾病名录(OIE Listed diseases),为须申报的(notifiable)动物传染病,我国也将其列为一类传染病。我国主要通过接种猪瘟兔化弱毒疫苗(hog cholera lapinized virus, HCLV)来控制猪瘟,该苗具有很好的免疫效力和安全性,但不能通过血清学方法对CSFV野毒感染猪和疫苗接种猪进行鉴别诊断。该疫苗的使用在控制猪瘟的同时严重的影响了我国牲猪及猪制品的贸易,也不利于猪瘟的根除。研制新型的安全有效且能利用血清学方法对免疫猪和感染猪进行区分的猪瘟标记疫苗具有重要意义。目前有多种新型的猪瘟标记疫苗正在研制中,本实验室也构建了基于甲病毒复制子载体、表达猪瘟病毒E2蛋白的新型猪瘟DNA疫苗(pSFV1CS-E2),该苗可以保护猪只免受猪瘟强毒的攻击,但在攻毒前,免疫猪只的抗体水平并不高,这暗示了该疫苗可能可以诱导细胞免疫,并且细胞免疫在猪瘟的保护性免疫中具有重要作用。本研究旨在验证甲病毒复制子DNA疫苗可以诱导细胞免疫,并进一步研究提高甲病毒复制子免疫效果的方法。将猪瘟病毒E2基因插入到痘苗病毒穿梭载体,然后进行同源重组,利用5′-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU)加压筛选和蓝白斑筛选,构建了表达E2蛋白的重组痘苗病毒,通过PCR、间接免疫荧光试验和Western blot对重组病毒进行了验证。用重组痘苗病毒免疫小鼠后,检测到了E2抗体的产生。该重组痘苗病毒可以进一步用于加强复制子DNA疫苗免疫效果,也可以用于复制子疫苗细胞免疫效果的评价。在pSFV1CS-E2的基础上,构建了融合表达E2蛋白和伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV ) VP22蛋白的复制子DNA疫苗pSFV1CS-E2-UL49 ,然后将pSFV1CS-E2和pSFV1CS-E2-UL49免疫小鼠,用基于CFSE染色的淋巴细胞增殖试验、WST-8淋巴细胞增殖试验分析了免疫小鼠的淋巴细胞增殖反应,同时用细胞因子ELISA和细胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining, ICS)试验检测了免疫小鼠淋巴细胞的细胞因子产生。结果显示,与空载体pSFV1CS相比,pSFV1CS-E2和pSFV1CS-E2-UL49免疫小鼠都产生了抗原特异性的淋巴细胞增殖反应和细胞因子,其中pSFV1CS-E2-UL49免疫小鼠产生的淋巴细胞增殖反应和更多细胞因子高于pSFV1CS-E2免疫小鼠。pSFV1CS-E2和pSFV1CS-E2-UL49都可以诱导细胞免疫,并且pSFV1CS-E2-UL49诱导的细胞免疫效果更强,但这两种复制子疫苗诱导的抗体水平都比较低。为了进一步提高此疫苗的体液免疫及细胞免疫应答,我们先用甲病毒复制子DNA疫苗pSFV1CS-E2-UL49免疫小鼠后,再分别用pSFV1CS-E2-UL49、表达E2蛋白的重组腺病毒rAdV-E2和杆状病毒表达的重组蛋白rE2进行加强免疫。然后用间接ELISA和阻断ELISA检测了不同免疫组合诱导的抗体水平;用CFSE淋巴细胞增殖试验和WST-8淋巴细胞增殖试验检测了免疫小鼠的淋巴细胞增殖反应;用ICS试验检测了抗原特异性细胞因子产生细胞水平。结果显示,与用pSFV1CS-E2-UL49加强免疫相比,利用rAdV-E2和rE2加强免疫可以明显提高抗体产生水平,从rAdV-E2加强免疫小鼠脾中检测到明显高的淋巴细胞增殖反应和细胞因子产生细胞。为了进一步在猪体上研究复制子DNA疫苗诱导的细胞免疫效果及prime-boost免疫策略对细胞免疫的加强效果,利用活细胞染料CFSE对猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)进行染色,用多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)对细胞进行刺激,初步建立了基于CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法,利用该法可以在猪体上评价疫苗的细胞免疫效果。本研究证明,表达CSFV E2蛋白的甲病毒复制子DNA疫苗可以诱导特异性细胞免疫,PRV VP22可以加强与之融合抗原的免疫原性,利用重组腺病毒可以显著提高复制子DNA疫苗的体液免疫及细胞免疫应答水平,使用复制子DNA疫苗初免、重组腺病毒加强免疫有望成为一种有效的免疫策略。