论文部分内容阅读
夏枯草(Prunella vulgaris L.)为唇形科多年生草本植物,以干燥果穗入药,2005年版《中国药典》收载,具有降血压、降血糖、抗艾滋病和抗肿瘤等药理作用,广泛应用于医药、化工、食品、饮料等诸多领域。夏枯草主产江苏、安徽、浙江和河南等地,但各地夏枯草种质资源来源复杂,严重影响药效的稳定性。药材质量是保证中药有效的前提,种质遗传多样性是影响药材质量的根本内在机理。本研究搜集了我国夏枯草主产区的15个省(市)41份种质资源,在阐明其种质资源遗传特性和综合评价药材质量的基础上,探讨种内变异与药材质量的关系,选择稳定的优质的类群,保证临床用药的安全有效,为夏枯草资源的保护及优良种质的鉴定提供理论依据,从源头上促进夏枯草资源的开发利用和现代中药产业发展。具体研究内容和结果如下:(1)对41份夏枯草不同种质资源的16个植物学性状进行分析。结果显示,夏枯草不同居群在植物性状上存在丰富的遗传变异。应用主成分分析法初步确定茎高、叶形指数、花冠长度、花冠喉部宽、花萼长、下唇宽、上唇宽、主枝果穗长为影响夏枯草表型差异的主要因素。根据16个形态性状,夏枯草不同居群可聚为三类,分别为高大早熟型、中间型、矮小晚熟型。(2)应用扫描电镜SEM (Scanning Electron Microscope)技术,对26份不同夏枯草居群进行花粉形态观察和比较研究。结果显示,夏枯草花粉近球形至扃球形,赤道面观长椭圆形或宽椭圆形,极面观近圆形。萌发沟均为6个,辐射对称,沟膜上密布颗粒物。花粉表面具网状雕纹,网眼为不规则多边形至近圆形,大小不一。不同居群在花粉大小、花粉形状、外壁纹饰等方面存在差异。花粉外壁纹饰差异主要表现在网脊宽度、网胞形状、网胞直径和网胞密度,其演化顺序可能为网胞排列由密到疏,由均匀到不均匀,由规则到不规则,网脊由宽到窄。(3)利用ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats)分子标记技术对夏枯草遗传多样性进行了分析。结果表明,在物种水平上,多态性位点百分率(PPL)高达89.19%,Nei’s多样性指数(He)平均为0.29。居群水平上,PPL在11%~50%之间,最高为福建建瓯,最低为云南昆明,平均为45.04%。Nei’s基因分化系数(Gst)为0.5177,表明居群内的遗传变异较大,居群间存在一定的分化。当相似系数为0.79时,可将供试的26个夏枯草居群分为三大类群。第一类群来自于江苏地区夏枯草居群,第二类包括安徽、贵州、江西和浙江等地居群,第三类则多为西南地区居群。来自同一地区的夏枯草大部分聚为一类,与地理分布和气候类型存在一定的联系,但不是完全按照其进行划分。(4)应用SRAP (Sequence-Related Amplified Polymorphism)标记对26份夏枯草资源进行遗传多样性水平和遗传结构分析。结果表明,在物种水平上,多态性位点百分率(PPL)高达87.93%,Nei’s多样性指数(He)平均为0.21。居群水平上,PPL在22%-67%之间,最高为浙江湖州居群,最低为云南昆明居群,平均为32.27%。Nei’s基因分化系数(Gst)为0.4850,表明居群内的遗传变异较大,居群间存在一定的分化。采用类平均法对26份夏枯草资源进行聚类分析,聚类结果与ISSR标记结果略有差异,但基本呈现一致性。(5)对我国不同地区夏枯草核糖体ITS (Intergenic Spacer region)碱基序列差异进行比较分析。结果显示,ITS区长度均为669 bp, ITS1、5.8s和ITS2序列长度分别为260bp、55bp和254bp。整个ITS区共有7个变异位点,ITS1区内有4个变异位点,均为信息位点。ITS2区内有3个变异位点,均为单核苷酸变异位点。5.8S区域内非常保守,没有变异位点。根据两者序列以邻接法建立分子系统发生树,表明夏枯草种内至少存在5个变异类型,江西进贤栽培构成一单系分支,与所有野生居群区别开。(6)以熊果酸、齐墩果酸、黄酮、多糖等生物活性成分为评价指标对夏枯草药材质量进行评价。结果表明,熊果酸等评价指标较为合理、客观,能充分地反映和控制夏枯草总体质量水平。不同居群夏枯草主要化学组分相似,但含量存在显著差异。熊果酸含量在0.13%-0.40%之间;黄酮含量在2.16%-10.29%之间;多糖含量在5.29%-9.00%之间;所有化学成分均以四川泸定含量最高,说明夏枯草种质筛选潜力巨大。通过聚类分析可将36份夏枯草种质分为五类,应加强第二和第五类群的选育工作,为夏枯草药材的质量评价及发展道地药材生产提供了依据。(7)运用等离子体发射光谱法(ICP-AES)测定了夏枯草中13种无机元素含量。结果表明,不同居群夏枯草中均含丰富的宏量元素和微量元素,其分布特征较为一致,Ca、K含量最高,其次是Mg、P,最后依次是Fe、Al、Sr、Mn、Zn、Ti、Cu、Pb、Co。但不同居群中各种元素的含量差异显著,这可能与不同种质遗传因素和土壤环境中各种元素的丰度密切相关。Pb、Fe、Cu、Ti、Al、Co之间存在较大的正相关性,说明夏枯草对其吸收可能存在一定的协同作用。应用主成分分析初步确定夏枯草的特征元素为Co、Fe、Cu、Ti、Al、P、Mg。(8)以活性成分、商品性状、检查项目等为指标,分别采用层次分析和综合主成分分析法,综合考察夏枯草不同居群药材质量,为夏枯草药材质量控制提供理论依据。结果显示:层次分析和综合主成分评价均能较全面的反映样本信息,可用于中药多指标的质量评价。两种评价方法均显示,四川泸定、四川绵阳活性成分含量远高于其他居群,但果穗短小,适合于精品生产。江苏南京玄武、江苏镇江、江苏仪征、江苏盱眙、安徽合肥、安徽滁州等地夏枯草活性成分含量较高,果穗较长,产量较高,综合性状良好,适合于种植推广(9)对夏枯草不同部位活性成分含量进行比较分析,为合理开发利用夏枯草资源提供理论依据。研究结果显示,夏枯草不同部位活性成分含量存在明显的差异。熊果酸在不同部位中含量为:果穗>全草>叶片>茎>根;黄酮含量顺序为:叶片>全草>果穗>茎>根;多糖含量顺序为:叶片>根>茎>全草>果穗;无机元素Pb、Cu、Fe、Co、 Al、Mn、Ti在根中含量最为丰富,K、P、Ca含量较少;而果穗与之相反。因此,利用夏枯草果穗的同时,应积极开发利用叶片等非传统药用部位,以扩大夏枯草药源,实现资源可持续发展。