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目的 应用慢病毒建立钙调蛋白依赖性激酶II(Calmodulin-dependent kinase II,CaMKII)δ过表达载体,以之转染前破骨细胞-RAW264.7细胞,并应用不同浓度CaMKs抑制剂KN93处理,来探索CaMKⅡδ过表达对破骨细胞分化中信号分子cfos、c-jun表达的影响,以揭示CaMKⅡδ在破骨细胞分化中的作用及可能的下游信号分子,为进一步揭示破骨细胞分化调控的信号通路提供实验依据。方法 1 CaMKⅡδ过表达慢病毒载体稳定转染株的构建。用慢病毒构建CaMKⅡδ过表达载体,转染Raw264.7细胞株,加入4μg/mL嘌呤霉素筛选出CaMKⅡδ过表达稳定转染株;然后Western-blot检测CaMKⅡδ在细胞中稳定过表达。2 CaMKs抑制剂KN93适宜浓度的筛选。细胞分成九组:对照组细胞不进行病毒转染;阴性载体组和阳性载体组则分别为转染空白载体和CaMKⅡδ过表达载体的细胞;0.1μMKN93、0.5μM-KN93、1μM-KN93、2μM-KN93、3μM-KN93、5μM-KN93组,细胞在转染CaMKⅡδ过表达载体的同时,分别用0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、5μM浓度的KN93进行处理。在接受上述处理的同时,均用50ng/mL RANKL进行诱导。在细胞培养的过程中用倒置相差显微镜观察细胞状态,并应用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及骨吸收陷窝检测评价破骨细胞生成及骨吸收情况,筛选出能有效抑制破骨细胞分化又对细胞增殖影响较小的适宜KN93浓度,用于下一步实验。3 CaMKⅡδ过表达及KN93对c-fos、c-jun基因表达的影响。实验分为六组:分别为对照组、阴性载体组、阳性载体组、0.5μM-KN93组、1μM-KN93组和2μM-KN93组,后三组在转染CaMKⅡδ过表达载体的同时,分别用0.5μM、1μM、2μM KN93进行处理。同时用50ng/mL RANKL处理24小时后收获,通过Realtime PCR和Western-blot检测c-fos、c-jun基因表达情况。4抑制剂KN93作用下CaMKⅡδ过表达对c-fos、c-jun基因表达的影响。实验分成三组:对照组、阴性载体组和阳性载体组。于接种24小时后同时加入50ng/mL RANKL及1μM浓度KN93,24小时后收获细胞,Real-time PCR和Western-blot检测两组细胞中信号分子c-fos、c-jun表达情况。结果 1 CaMKⅡδ过表达慢病毒载体稳定转染株的构建。成功构建了CaMKⅡδ过表达载体稳定转染细胞株。Western-blot检测过表达载体组CaMKⅡδ蛋白光密度值与对照组、阴性载体组相比分别上升了71.26%、77.01%(P<0.01),空白对照组与阴性载体组无明显差异(P>0.05);说明CaMKⅡδ过表达载体构建成功。2 CaMKs抑制剂KN93适宜浓度的筛选。经RANKL诱导3、5天后,对照组、阴性载体组、阳性载体组和0.1μM-KN93组细胞生长良好,细胞数目无显著性差异(P>0.05);而0.5μM-KN93~5μM-KN93组细胞数均显著低于阳性载体组(P<0.01),各组细胞生长呈KN93剂量依赖性抑制,且2μM-KN93~5μM-KN93组不仅细胞生长受到抑制,部分细胞还出现崩解死亡。TRAP染色及骨吸收陷窝检测显示,对照组、阴性载体组、阳性载体组和0.1μM-KN93组破骨细胞数目、骨吸收陷窝数目及面积组间比较差异无统计学意义(P>0.05);而0.5μM-KN93组破骨细胞数目、骨吸收陷窝数目及面积较阳性载体组分别降低了36.35%(P<0.01)、42.86%和61.57%(P<0.05);1μMKN93组破骨细胞数目较阳性载体组降低了96.59%(P<0.01),无骨吸收陷窝形成;而2μM-KN93~5μM-KN93组既无破骨细胞形成,也未见到骨吸收陷窝。上述结果提示,CaMKⅡδ过表达对破骨细胞增殖、生成及骨吸收功能均无显著性影响;在CaMKⅡδ过表达情况下,0.5μM~1μM的KN93可显著抑制破骨细胞增殖、生成及骨吸收功能;当KN93浓度≧2μM时,不仅细胞增殖受到显著抑制,而且会造成部分细胞崩解死亡,不适于下一步实验研究。3 CaMKⅡδ过表达及KN93对c-fos、c-jun基因表达的影响。实时荧光定量PCR检测显示,c-fos、c-jun mRNA相对表达水平在对照组、阴性载体组、阳性载体组无显著性差异(P>0.05);而0.5μMKN93组、1μM-KN93组和2μM-KN93组c-fos mRNA相对水平较阳性载体组分别上升了29.62%、200.84%和14.62%(P<0.01),c-jun mRNA相对水平分别上升了171.91%、460.55%和192.80%(P<0.01)。Western-blot检测显示,对照组、阴性载体组、阳性载体组c-fos、c-jun蛋白表达差异也无统计学意义(P>0.05);0.5μMKN93组、1μM-KN93组和2μM-KN93组c-fos蛋白水平较阳性载体组分别上升了43.80%、238.90%和56.20%(P<0.01),c-jun蛋白水平分别上升了113.39%、207.09%、176.16%(P<0.01)。上述结果说明,CaMKⅡδ过表达对破骨细胞分化中cfos、c-jun蛋白表达无显著性影响,而在CaMKⅡδ过表达情况下,KN93可显著提高c-fos、c-jun蛋白表达水平。由于KN93是CaMKs的抑制剂,因而提示c-fos、c-jun可能参与了CaMKs对破骨细胞分化的调控。4抑制剂KN93作用下CaMKⅡδ过表达对c-fos、c-jun基因表达的影响。在1μM抑制剂KN93作用下,阳性载体组c-fos、c-jun mRNA相对表达水平较对照组分别下降了37.67%和83.05%(P<0.01),蛋白相对水平则分别下降了67.68%和88.02%(P<0.01);而阴性载体组c-fos、c-jun mRNA及蛋白相对水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。上述结果说明,在1μM KN93作用下,CaMKⅡδ过表达可显著降低破骨细胞分化中c-fos、c-jun基因表达,提示c-fos、c-jun参与了CaMKⅡδ对破骨细胞分化的调控。结论 1 CaMKⅡδ过表达(高于生理水平的CaMKⅡδ)对破骨细胞增殖、分化、骨吸收功能以及c-fos、c-jun基因表达均无显著性作用;2在CaMKⅡδ过表达情况下,0.5μM~1μM的KN93可显著抑制破骨细胞增殖、生成及骨吸收功能;当KN93浓度≧2μM时,可造成部分细胞崩解死亡。3在CaMKⅡδ过表达情况下,CaMKs抑制剂KN93可显著上调c-fos、c-jun基因表达水平,提示c-fos、c-jun可能参与了CaMKs对破骨细胞分化的调控;4在1μM KN93作用下,CaMKⅡδ过表达可显著降低破骨细胞分化中c-fos、c-jun基因表达,提示在CaMKII受到抑制时,c-fos、c-jun参与了CaMKⅡδ对调控破骨细胞分化的调控。图11幅;表16个;参70篇。