论文部分内容阅读
Neuroligin(NL)家族蛋白(NL1-4)是一类突触后膜的细胞粘附分子，与其在神经系统中的定位相一致，NL1/3和NL2/4分别选择性参与兴奋性突触和抑制性突触的形成。疾病遗传学研究发现NL基因突变与人类孤独症谱系障碍(ASD)密切相关，孤独症为一种广泛性发育障碍的代表性疾病，研究发现将相应的NL缺失或突变体引入小鼠中，小鼠也表现出一定的孤独症样行为。Adaptor protein containing PH domain, PTB domain and Leucinezipper motif(APPL)是一种细胞衔接蛋白，现已发现APPL1和APPL2两种亚型。APPL1蛋白能够通过PI3K/Akt信号通路调控海马神经元突触的形成。免疫共沉淀结合质谱分析结果表明，NL和APPL1之间存在相互作用。 目的:验证NL与APPL1之间的相互作用，并进一步探究NL1和APPL1在突触形成过程中相关分子机制的研究。 方法:运用细胞转染、免疫共沉淀技术、病毒介导的基因敲减、免疫细胞化学染色以及荧光成像技术验证体内和体外NLs和APPL1的相互作用以及它们在突触形成过程中相关分子机制研究。运用HEK293T细胞制备NL-AAV病毒，并用免疫印迹技术、免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色和荧光成像方法，验证NL-AAV的感染效率。 结果:在体内和体外条件下，NLs和APPL1间有相互作用。在培养的海马神经元中，外源转染的HA-NL1与APPL1有部分的共定位，NL1/APPL1/PSD95/GluN2A形成了一个多蛋白复合物。在培养的海马神经元中，过表达NL1能够降低pAkt473磷酸化水平(p＜0.05);shRNA敲减NL1蛋白能够增强pAkt473磷酸化水平(p＜0.05);过表达APPL1能够降低pAkt473磷酸化水平(p＜0.05)，同时Akt的表达水平没有明显变化。在NL1敲除小鼠脑的免疫印迹结果表明，全脑、大脑皮层以及小脑三个不同脑区中pAkt473的磷酸化水平都有增加的趋势。包装的NL-AAV在神经元中有着较高的感染效率，可满足一般的生化实验，但在动物活体中感染效率不高。 结论:这些结果提示NL1可能是通过APPL1/Akt这个信号通路发挥其突触形成作用。