目的：湿疹-皮炎是一种瘙痒性、复发性的皮肤病,对患者生活有严重影响。目前湿疹-皮炎的治疗还是个难题,传统的皮质类固醇激素和免疫抑制剂均有不可忽视的副作用,且不能长期应用,开发研究中药成为湿疹-皮炎治疗的发展趋势。中医中药是中华民族历史文化和现代文明的重要组成部分,中药治疗湿疹-皮炎在中医医籍上早有记载,为后人进一步研究和开发中药提供了丰富的空间和资源。中药复方茯苓汤(Fu Fang Fu Ling Tang, FFFLT)由茯苓、赤芍、栀子、泽泻、黄柏、当归、浮萍、甘草组成,前期的实验研究及临床应用证明,复方茯苓汤对小鼠变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis, ACD)有显著抑制作用,临床也可有效治疗湿疹-皮炎。但复方茯苓汤的化学成分及其有效抗炎成分尚未研究,使其临床应用、质量控制、产业化都受到限制。近十年来,基于液相色谱的技术被广泛应用于中药的质量控制,尤其是LC的联用技术液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectra, LC-MS)和液相色谱-二极管阵列检测器(liquid chromatography-photodiode array detector, LC-DAD),分别作为首选技术用于复杂中药样品中目标化合物的定性和定量分析。目前,超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography, UPLC)和超高速液相色谱(ultra fast liquid chromatography, UFLC)由于其色谱柱选用微粒填料,能获得更高的柱效,节省分析时间,提高分析通量,适于快速分析植物样品及天然产物,同时也推动了中药药理活性作用的研究。肝脏是药物主要的和重要的代谢器官,是药物生物转化的主要场所,大多数药物的Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应都是在肝药酶系统的参与下发生的,因此药物的体外代谢模型主要是以肝脏为基础的,并以其特有的优势和特点在药物代谢的研究中得到广泛的应用。目前,有关药物代谢研究的热点主要是以肝微粒体和肝细胞为基础,通过分离培养的肝细胞及重组单酶进行药物的体外代谢研究,了解药物的代谢途径、代谢稳定性及经代谢酶生物转化的代谢产物,也可考察药物经代谢后对细胞的毒副作用。湿疹-皮炎的免疫发病机制与T淋巴细胞密切相关。Thl和Th2型细胞亚群的平衡保持着机体正常免疫功能,而Th1／Th2免疫模式的确定是以Thl和Th2型细胞因子水平为主要依据。表皮海绵肿是湿疹-皮炎特征性病理变化,其机制是T细胞诱导的角质形成细胞凋亡。湿疹-皮炎的活化CD4+T细胞分泌IFN-γ,是引发皮肤病理的主要细胞因子之一。本研究以中药复方茯苓汤为研究对象,先对复方茯苓汤在植物活性成分分离平台上用超高速液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾-质谱(UFLC-DAD-ESI-MS)等方法进行主要化学成分分离,分析和鉴定；再结合中药分析鉴定结果,选用2,4-二硝基氟苯(DNFB)诱导的小鼠变应性接触性皮炎(ACD)模型为药效学实验模型,进一步确定复方茯苓汤在活体内的抗炎有效成分；再选取有效成分单体及其体内脱糖代谢产物进行体外药物代谢研究,了解其代谢途径、鉴定其代谢产物；最后,从有效成分单体中选定目标化合物,研究其对人外周血T淋巴细胞增殖的抑制、诱导凋亡,细胞周期的变化及对Thl.Th2型细胞因子的影响,从分子水平和免疫调节机制方面探讨FFFLT中的目标化合物对湿疹-皮炎发病机制的影响。通过上述实验,为复方茯苓汤的临床应用提供理论依据。方法和结果：全文共分四部分。第一部分是采用UFLC-DAD-ESI-MS法分析复方茯苓汤的主要化学成分与质量控制。色谱条件：分析柱为Shim-pack XR-ODS(75 mm×2.0 mm,2.2μm)和Shim-pack XR-ODS(100 mm×2.0 mm,2.2μm),以乙腈(A)及0.1%甲酸-水(B)为流动相,采用梯度程序洗脱,流速为0.4 mL／min,柱温设定在40℃。质谱条件：在正负离子模式下分别扫描,检测器电压分别为+1.55kV与-1.55kV；扫描范围为m/z100-500；曲线脱溶剂管和加热块温度均为250℃,接口电压为4 kV,CDL电压为40 V；雾化气(氮气)流速设定在1.5 L／min,干燥气压力设定为0.06 MPa。结果：复方茯苓汤中共分析出14种成分,其中主要化学成分为京尼平龙胆双糖苷,京尼平苷,芍药苷及甘草苷,其最大吸收波长分别为239 nm,239 nm,230 nm及276 nm。在本研究方法下,京尼平龙胆双糖苷,京尼平苷,芍药苷及甘草苷的保留时间分别为4.30min,4.84min,5.46min及6.11 min,四种成分的定量线性范围在1.0 ng-200 ng之间,线性相关系数R2介于0.9998-1.0之间,日内差及日间差测定显示4个目标物的保留时间及峰面积相对标准偏差均小于1.7%；平均加样回收率介于95%-104%之间。第二部分是研究复方茯苓汤作用于小鼠皮炎的有效组分。用2,4-二硝基氟苯(2,4-Dinitrofluorobenzene,DNFB)诱发的小鼠变应性接触性皮炎为动物模型,比较灌饲不同中药组合(Ⅰ-Ⅳ)及阳性对照氢化可的松和阴性对照生理盐水的药效学指标：Ⅰ组为茯苓,泽泻,黄柏,栀子,赤芍,浮萍,当归,甘草8味中药(复方茯苓汤)的水提物,Ⅱ组为栀子,赤芍,甘草3味中药的水提物,Ⅲ组为茯苓,当归2味中药的水提物,Ⅳ组为茯苓,栀子,赤芍,当归,甘草5味中药的水提物。观察中药对小鼠耳重量、耳厚度、耳真皮炎性细胞浸润以及血清细胞因子的影响。结果：与生理盐水组比较,不同中药组和氢化可的松组对诱发皮炎前后小鼠的耳重量差、耳厚度差及真皮炎症细胞浸润的影响均有显著差异(P<0.05),其中,8味中药组、5味中药组和氢化可的松组更优(P<0.01)。与生理盐水组比较,氢化可的松组和中药组小鼠血清IFN-γ水平均有显著降低(P<0.05),8味组和氢化可的松组尤为明显(P<0.01)；而各组IL-4,IL-10水平无显著性差异(P>0.05)。第三部分是对该复方中的有效成分单体及其体内脱糖代谢产物进行体外代谢研究。采用体外肝微粒体孵育体系及肝细胞培养体系结合超快速液相色谱-质谱(UFLC-MS)技术,通过特异性细胞色素酶(CYP)抑制剂,重组单酶及相关性分析,对以上成分进行代谢酶研究及主要代谢产物分析。结果：芍药苷、京尼平苷、京尼平、甘草苷都不经肝脏Ⅰ相酶代谢；甘草苷的脱糖产物甘草素与人肝微粒体(HLMs)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-孵育体系孵育30 min后,产生一个代谢产物,为4’,5,7-三羟基黄酮。采用9种主要CYP的选择性抑制剂来测定HLMs中产生4’,5,7-三羟基黄酮的CYP亚型,确定CYP1A2为生成该代谢产物的主要代谢酶。第四部分是研究芍药苷抑制人外周血T淋巴细胞增殖、诱导凋亡及其对Th1及Th2型细胞因子的影响。采用SRB法检测CD3+CD28共刺激下的T淋巴细胞增殖及芍药苷对其增殖的抑制,流式细胞术检测芍药苷诱导T淋巴细胞凋亡及其细胞周期的变化,ELISA法分析芍药苷对T淋巴细胞上清中细胞因子的影响。结果：不同浓度芍药苷加药组与CD3+CD28组相比较,可呈浓度依赖性抑制CD3+CD28共刺激下的T淋巴细胞增殖(P<0.01)；不同浓度芍药苷加药组诱导活化的T淋巴细胞凋亡与CD3+CD28组比较,有显著性差异(P<0.01)。与CD3+CD28组相比较,不同浓度芍药苷加药组均能显著降低T淋巴细胞上清液中IFN-γ的水平(P<0.01),而对T淋巴细胞上清液中IL-4水平的影响无显著性差异(P>0.01)。结论：1.本研究采用UFLC-DAD-ESI-MS法首次对复方茯苓汤的化学成分进行分析,共分析出14种成分,其中主要化学成分是京尼平龙胆双糖苷,京尼平苷,芍药苷及甘草苷。2.基于UFLC-DAD技术开发了复方茯苓汤中京尼平龙胆双糖苷,京尼平苷,芍药苷及甘草苷4种主要化学成分的快速定量分析方法。该方法快速、灵敏,稳定可靠,适于分析复方茯苓汤提取物中的活性成分,可用于复方茯苓汤原材料的质量控制。3.复方茯苓汤的主要药效成分多来源于栀子,赤芍,甘草,茯苓和当归5味中药。复方茯苓汤抑制DNFB诱发的小鼠ACD的作用机制可能与降低IFN-γ水平有关。4.复方茯苓汤中甘草苷的脱糖产物甘草素可被肝脏Ⅰ相酶代谢,代谢产物是4’,5,7-三羟基黄酮,CYP1A2为生成该代谢产物的主要代谢酶。澄清甘草素的代谢产物和代谢酶有利于对代谢产物的药理和毒理学活性进行深入研究,也可指导含甘草素药物的临床用药。5.复方茯苓汤中芍药苷可抑制CD3+CD28共刺激的人外周血T淋巴细胞增殖,诱导T淋巴细胞凋亡,芍药苷可呈浓度依赖性显著抑制培养的人T淋巴细胞上清中IFN-γ水平,其抗炎机制可能是通过诱导T淋巴细胞凋亡、降低IFN-γ水平来起作用。