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输卵管黏膜维护了输卵管腔配子运输和胚胎发育的内环境,而感染或慢性炎症造成的黏膜损伤和免疫功能失调,会引起输卵管疾病并会导致雌性动物生产、生殖能力下降。雌激素对输卵管免疫稳态具有重要的调控作用,本研究通过转录组分析筛选雌激素调控输卵管黏膜免疫功能的关键因子,并进一步探究其受调信号通路和免疫调节作用。本研究补充了雌激素对输卵管黏膜免疫的调控分子机制,并对于输卵管炎症损伤的恢复有指导作用。研究内容如下:RNA-seq检测输卵管上皮细胞在10-8M 17 β-雌二醇(E2)作用0h、1.5h、3.5h、5.5h后差异表达基因。结果显示,输卵管黏膜上皮细胞经E2处理后不同时间组显著差异表达基因呈动态变化,差异基因最多达到324个。GO功能富集分析表明,差异基因富集在细胞增殖分裂、细胞分化、细胞连接、免疫和炎症反应等相关功能中,其中富集在免疫相关功能中的差异基因包括S100A8、S100A9、S100A12、PTX3、LBP、NUPR1、CXCR4 等,且不同作用时间 S100A8、S100A9、CXCR4的变化显著两两相关。KEGG分析表明差异基因在细胞因子信号通路、MAPK信号通路、白细胞跨内皮迁移、钙信号、花生四烯酸代谢等通路富集。免疫组织化学检测发现健康间情期的绵羊输卵管黏膜上皮中丰富表达S100A8和S100A9。之后利用10-8M E2在不同时间(5h、6h、7h、8h)作用输卵管上皮细胞,q-PCR检测发现S100A8和S100A9在作用7h后相比对照组显著升高并达到峰值,且不同 E2 浓度(10-5M,10-6M,10-7M,10-8M,10-9 M)对 S100A8和S100A9均有上调作用,其中10-7M和10-8M组S100A8和S100A9的表达量最高,但两组之间差异不显著。免疫细胞化学法同样显示S100A8和S100A9在10-8 M E2作用7h后相比对照组表达升高。三种受体抑制剂或组合作用输卵管上皮细胞,q-PCR及WB法检测S100A8和S100A9的表达变化。结果显示ER拮抗剂Tamoxifen、Fulvestrant与GPER抑制剂G-15对S100A8和S100A9的表达均有抑制作用,所以E2是通过同时激活经典受体ER和膜受体GPER,共同上调靶基因S100A8和S100A9的表达。之后MAPK三个激酶家族抑制剂或组合作用输卵管上皮细胞,q-PCR及WB法检测S100A8的表达变化。发现JNK抑制剂SP600125对S100A8的表达有明显的抑制作用,而P38 MAPK抑制剂SB203580及ERK1/2抑制剂U0126在mRNA和蛋白质水平上没有表现出对S100A8的抑制作用。最后检测几种雌激素受体抑制剂或组合对E2作用下输卵管上皮细胞JNK的作用,发现ER抑制剂Tamoxifen、Fulvestrant与GPER抑制剂G-15都可抑制JNK的激活,说明E2能够通过不同膜受体ER和GPER激活JNK。综上所述,E2可通过不同的mER(ER、GPER)激活JNK进而影响S100A8的表达。通过双g-RNA CRISPR/Cas9技术敲低输卵管黏膜上皮细胞中的S100A8基因,并检测相关免疫因子IL-1β、IL-10的变化。结果显示S100A8的敲低会导致IL-10降低和IL-1β的升高,说明生理情况下S100A8在一定程度上调抗炎因子IL-10和下调炎症因子IL-1β,维持输卵管的免疫稳态。S100A8基因敲低后,雌激素可上调IL-10的水平,这可能是S100A8功能缺失的代偿机制,并对下游因子IL-1β产生负反馈调节。