论文部分内容阅读
近年来用基因工程方法从软骨鱼和骆驼科动物中克隆到的单域抗体(single-domainantibody，sdAb)具有无轻链、单一重链可变区保留了完整的抗原结合活性的特征。这类单域抗体具有分子小、稳定性高、体内组织渗透性好、可溶性好、易表达、抗原识别表位独特的特性，已引起生物技术研究与诊断治疗应用领域的广泛关注。
胞内抗体（Intracellular antibody，Intrabody）是一类在细胞内表达，特异性地靶向胞内抗原，以实现对其功能的阻断或者调节的新型基因工程抗体。除了经典的细胞内表达的策略，近年来，随着研究的深入，人们发现了细胞穿透肽（cell penetration peptide）具有跨越细胞膜的能力，这类小分子肽段可以将蛋白、特异性抗体片段等大分子物质携带进入细胞，从而产生特定的中和作用，有可能实现胞内抗体分子对临床疾病的治疗。同时，寻找合适大小的抗体片段也是研制有效胞内抗体的重要前提。
近几年来，随着结核分枝杆菌耐药性菌株的不断出现和卡介苗(bacille Calmette-Guerin，BCG)免疫能力的减弱，结核病在全球范围内的发病率呈上升趋势。而结核病的诊断和治疗是结核病防控的重要环节，结核病是目前临床上诊断最为复杂的疾病之一，现有临床诊断技术在准确性和及时性上仍显不足，痰涂片抗酸染色法(sputumsmearmicroscopy)只有在患者痰液中M.tb含量很高的时候才能检测为阳性，因此很容易出现假阴性;痰结核菌培养法(sputum culture test)能提供更高的准确性，但此法周期长（三周至两个月），可能延误治疗;基于迟发型超敏反应的PPD皮试试验则由于受检者接种过BCG而出现假阳性，也很难区分潜伏感染和活动期结核病;而当前结核病的治疗药物基本是在上世纪初发展起来的抗菌药物，特异性差，治疗时间长，且副作用大，并随着耐药结核的出现，药物治疗效果日益受到挑战。为此，从宿主抗结核免疫应答方面在诊断和治疗方面寻找新的突破口，是目前结核病研究中的热点方向之一。
为此，本研究针对结核病防控的诊断和治疗两个出发点，开展以下研究:
一、新型结核病血清学诊断候选分子的筛选
血清学诊断是目前临床诊断中应用最为广泛的方法之一，国内临床上主要使用针对38KDa、16KDa和LAM三种抗原的血清学应答水平作为结核病的辅助诊断指标，但是在对结核病诊断的准确性和及时性上还存在不足。本研究利用课题组自行构建和表达的系列结核分枝杆菌抗原蛋白Rv1908c、Rv0733、Rv0899、Rv1411c和Rv3914，采用间接ELISA方法比较了活动期结核病患者与健康者对照组血浆中抗结核分枝杆菌抗原的IgG和IgM水平，结果显示活动性结核病患者中针对Rv1411c、Rv3914和Rv2031c的IgG水平明显高于正常人群，其中Rv3914的AUC值高于目前临床上正在应用的Rv2031c(即16KDa)，提示该抗原可能是结核病血清诊断的新的候选补充标志物;但是上述三种抗原的IgG水平在活动性结核病中不同临床表现中的差异不大，表明三种分子所诱导的体液免疫应答水平和临床分类关系不大。
二、抗结核分枝杆菌抗原重链可变区胞内抗体的制备和初步鉴定
以往的研究表明，结核分枝杆菌抗原Rv0733和Rv0899是结核分枝杆菌的包膜蛋白，其中Rv0899对H37Rv在THP-1分化的巨噬细胞中复制存在影响，并对H37Rv在低pH值培养基中的成长起促进作用。同时结核分枝杆菌临床株中存在这两个抗原的突变菌株。因此，我们认为这两个抗原在结核分枝杆菌的抗吞噬作用中起着关键作用，同时血清ELISA也发现这两个抗原的血清性应答水平也较低，因此，我们推测这两个分子在结核分枝杆菌被吞噬后产生作用，具有作为特异性胞内抗体靶点的价值。
为此，我们通过原核表达纯化Rv0733和Rv0899蛋白，从实验室已构建的109非免疫性羊驼重链可变区单域抗体噬菌体库中，筛选针对Rv0733和Rv0899的特异性羊驼重链。经过4轮富集后，使用ELISA方法检测相应抗体，共获得了22株Rv0733和35株Rv0899阳性单克隆，经测序后去除重复序列，获得10个抗Rv0733的VHH序列和5个抗Rv0899的VHH序列，并对上述序列进行了原核表达和纯化，完成了抗Rv0733的VHH亲和力的初步鉴定。
目前常用的细胞渗透肽(cell penepration peptide，CPP)为人免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiency virus-1，HIV-1）的转录活化因子(trans-activating transcriptionalactivator，Tat)第37-62位氨基酸残基组成的肽段和多聚精氨酸（如R9）。我们将筛选到的两株抗Rv0733的VHH抗体(TB-17-1和TB-17-6)构建了pET22b-ARG-VHH-17-1和pET22b-ARG-VHH-17-6表达质粒，经诱导表达和纯化后，分别将这两种纯化蛋白与分化为巨噬细胞的THP-1细胞共孵育，分别比较测定了单独VHH抗体分子和R9-VHH抗体蛋白对HEK293细胞和巨噬细胞系THP-1的渗透能力，初步结果显示R9-VHH融合抗体蛋白进入细胞的效率明显高于游离的VHH抗体分子，为后续其作为胞内抗体参与提高抗原递呈能力的研究奠定基础。