拟南芥AtPP2类韧皮部蛋白是一类具有韧皮部组织特异性的植物凝集素,研究表明它可能在植物韧皮部防卫反应(plant phloem-based defense, PBD)中起着决定性的作用,但是具体作用机制尚不清楚。本研究通过真空花絮渗透法获得了AtPP2-A1及其启动子的转基因拟南芥植株,并进行了PCR分子检测。同时借助于组织化学染色、GFP荧光显微观察等技术手段对其进行了初步的定位。ParA1是由寄生疫霉产生的一种小分子蛋白激发子,可诱导烟草叶片细胞发生过敏性坏死反应。表皮毛是位于叶片外层的结构,起着第一道防御屏障的作用。ParA1是否能引起表皮毛细胞的过敏反应?表皮毛对ParA1的反应与叶片其它组织的反应有何关系?本文着重对上述问题进行了初步研究。1拟南芥AtPP2-A1基因及其启动子转基因材料的产生和鉴定从拟南芥基因组DNA中克隆了AtPP2-A1基因的特异性启动子,构建了植物表达载体pBI121。利用根癌农杆菌(Agrobacerium tumefaciens) EHA105介导转化拟南芥Col-0生态型植株,最终筛选得到转基因拟南芥阳性植株。PCR分析确证外源GUS基因已转入拟南芥中。对转基因拟南芥进行GUS染色的结果表明该启动子和CaMV35S启动子一样均能驱动GUS基因的表达,前者仅在拟南芥韧皮部特异表达,而CaMV35S启动子驱动的GUS基因的表达为组成型表达。由此证明了该启动子在韧皮部特异而高效的表达特征,从而应用于拟南芥抗虫转基因研究。为进一步研究AtPP2-A1基因的亚细胞定位,将来自拟南芥的AtPP2-A1基因连入植物表达载体pBI121中,用荧光蛋白标记,构建了植物重组表达质粒pBI121-AtPP2-A1::GFP,由农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105介导,转化拟南芥生态型Col-0。获得了抗卡那霉素的转基因拟南芥植株,经PCR检测和荧光显微观察,证明AtPP2-A1基因已整合到拟南芥基因组中。2.ParA1诱导烟草表皮毛发生HR反应蛋白激发子ParA1注射烟草叶片后,可以引发植物过敏性细胞死亡(hypersensitve cell death, HCD). ParA1喷施烟草叶片后,可以引发植物产生微敏反应,并伴随有活性氧迸发(ROS burst)和染色质凝集(Chromatin condensation)现象的发生。表皮毛作为烟草外层的天然屏障,最早接触ParA1激发子并参与其诱导的micro-HR过程。以micro-HR发生过程中的重要信号分子H2O2和细胞中的染色质凝集为切入点,研究了表皮毛对于ParA1激发子诱导的响应。DCFH-DA染色及荧光观察结果表明,ParA1处理1h后表皮毛内就发生活性氧迸发,比叶肉细胞早2h,并且其产生的活性氧可以向叶肉细胞传导。DAPI荧光分析表明,表皮毛内染色质凝集的发生要比叶肉细胞早5h左右。苔酚蓝和中性红染色,配合质壁分离实验,证明了在ParA1处理后1h到12h中,细胞死亡从表皮毛向对应的底部细胞逐步扩散,表皮毛细胞死亡发生比叶肉细胞早约5h,且表皮毛在处理5h后的每个时间段内的细胞死亡数都明显高于叶肉细胞。RT-PCR方法检测了HR反应中的标志基因PAL、hin1和hsr203的表达,三个基因在ParAl处理后12h的表皮毛中都有表达,而在叶肉细胞中的基因表达相比表皮毛要稍晚一些。这些结果表明,HR信号有从表皮毛向叶肉细胞中传导的趋势。