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背景:核转录因子Nrf2（nuclear factor erythoid 2（NF-E2）related factor 2）属于Cap’n’collar（CNC）转录因子家族,调控多种编码抗氧化与解毒作用相关靶基因的表达,在细胞内抵抗氧化应激,维持细胞稳态。在多种肿瘤中均发现Nrf2高表达,并促进肿瘤恶性增殖与耐药。肿瘤细胞中的Nrf2表达异常活跃,增强了其抗氧化能力,并且通过调控代谢相关靶基因的表达,在肿瘤细胞中诱导代谢重编程（metabolic reprogramming）。近年来的研究发现,Nrf2通过转录和转录后调控,活化磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway,PPP）,也能促进丝氨酸（de novo serine synthesis,SSP）的从头合成和谷胱甘肽的（GSH,glutathione）的合成代谢,同时抑制脂肪酸氧化等分解代谢,对肿瘤生长和增殖发挥促进作用。SUMO（Small ubiquition related modifier）化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,对蛋白质在细胞中的生物学功能起调控作用,可以影响蛋白质在细胞中的定位、活性、稳定性等。SUMO化修饰过程是动态可逆的,SUMO特异性蛋白酶SENPs（SUMO-specific proteases）可以对底物蛋白去SUMO化。对于不同的底物蛋白,SUMO化修饰的作用各异。有研究报道,Nrf2可以被SUMO1及SUMO2/3修饰,Nrf2经SUMO2/3修饰后可循蛋白酶体途径降解,而Nrf2的SUMO1修饰则可增强下游靶基因的表达,在肝脏纤维化的发生发展过程中发挥作用。但Nrf2的SUMO1化修饰位点,及其在肿瘤中的生物学作用并未见报道。目的:在报道Nrf2可发生SUMO化修饰的基础上,在SENP1敲低的肿瘤细胞系中,研究SENP1敲低对Nrf2及下游靶基因的影响,进而观察对肿瘤细胞的生物学作用。在稳定过表达野生型Nrf2和SUMO1修饰位点突变的Nrf2蛋白、并敲减内源Nrf2表达的肝癌细胞株内,确定Nrf2的SUMO1修饰在肝癌生长中的作用并探索其生化和分子机制,为肝癌的靶向治疗提供新的思路。方法:1.在HEK-293T细胞中转染外源Nrf2与SUMO1表达质粒,通过Ni2+-NTA富集结合免疫印迹实验证实Nrf2可以被SUMO1修饰。对Nrf2序列进行相关软件分析,获得预测SUMO1修饰位点的基础上,进行了多个赖氨酸位点突变,Ni2+-NTA富集结合免疫印迹检测Nrf2的SUMO1修饰条带的变化,以确定修饰位点。2.通过Ni2+-NTA富集、免疫共沉淀证实SENP1可对Nrf2去SUMO化,通过免疫印迹、Realtime PCR、半衰期检测,研究SENP1对Nrf2表达和蛋白稳定性的影响。采用平板克隆形成实验,来确定SENP1敲减是否影响肿瘤细胞的体外成瘤和增殖能力。3.用慢病毒构建野生型Nrf2与SUMO1位点突变的Nrf2过表达肝癌细胞系,并在此基础上用shRNA敲低细胞中内源性Nrf2表达。在稳转细胞系中通过半衰期检测确定是否对Nrf2稳定性有影响,通过蛋白核质分离以及免疫荧光检测确定是否改变Nrf2的细胞内定位,采用荧光素酶报告基因检测确定Nrf2转录活性是否改变。用平板克隆形成和裸鼠成瘤等实验,观察Nrf2 K110位点的SUMO1修饰对肝癌细胞体内外生长的调控作用;用流式细胞仪检测细胞内ROS水平,RNA-seq、Realtime PCR、免疫印迹检测Nrf2下游靶基因的表达,确定Nrf2下游靶基因的表达水平,确定Nrf2 K110位点的SUMO1修饰对肝癌生长调控的分子机制。结果:1证实Nrf2可以发生SUMO1修饰,将潜在的位点依次突变后进行Ni2+-NTA富集检测,发现110位赖氨酸突变为精氨酸后,修饰条带消失,说明110位赖氨酸是Nrf2发生SUMO1修饰的位点。2.在外转Nrf2、SUMO1和SENP1的试验中证实Nrf2的SUMO1条带修饰可以被SENP1去除。在敲低SENP1的稳转细胞株中证实SENP1敲低可以在转录后水平上调Nrf2和下游代谢相关靶基因的表达,Nrf2的稳定性得以增强,肿瘤细胞克隆形成及增殖能力增强。3.在对Nrf2的K110位点SUMO1修饰的功能探究中,证实Nrf2的K110位点的SUMO1修饰并不影响Nrf2的稳定性、细胞内的定位以及转录活性。Nrf2的K110位SUMO1修饰在转录水平促进肝癌细胞内GPx2等抗氧化基因的表达,加速细胞内ROS清除,进而在翻译水平促进丝氨酸合成关键酶PHGDH的表达,增加内源丝氨酸合成,为核苷酸从头合成提供原料,促进肝癌体内外生长;并且发现丝氨酸饥饿可以诱导Nrf2的SUMO1修饰,维持肝癌生长。结论:本研究的结果提示,Nrf2的SUMO1修饰位点在K110位;肿瘤细胞中SENP1表达的上升可增强其稳定,提高其下游靶基因的表达,促进肿瘤生长;Nrf2的SUMO1修饰通过转录水平提高GPx2的表达,下调细胞内ROS水平,进而在翻译水平上调丝氨酸从头合成的关键酶PHGDH等的表达,促进肝癌体内外生长。