宫颈癌是全世界范围内女性中最常发生的恶性肿瘤之一，其目前的发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，具有较高患病率和致死率，是危害女性生命健康的重大公共问题。目前临床上宫颈癌的治疗方式主要有:手术治疗、放疗和化疗。化疗是治疗宫颈癌的方式之一，顺铂是目前临床上治疗宫颈癌常用的一种化疗药，能够控制肿瘤复发、转移;能够抑制肿瘤细胞的分裂并促进细胞凋亡，具有较强的治疗效果。但是顺铂在应用时会造成肾毒性、肝毒性和心脏毒性等副作用，更为严重的是顺铂在使用过程中可能会产生耐药性，大多数宫颈癌的化疗失败都是由于产生顺铂耐药抵抗，也就是耐药性。因此深入研究宫颈癌治疗过程中顺铂耐药性产生的分子机制，寻找更为积极、安全、有效的化疗方案是我们目前急需面对的问题。　　顺铂的耐药性受不同的因素影响:顺铂的吸收以及释放能力的变化、凋亡相关通路的改变，例如:丝裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(PKB/AKT)信号转导途径的影响、氧化应激反应、肿瘤微环境和表观遗传学、miRNA等。最新研究发现细胞自噬过程能够参与调控顺铂耐药性。细胞自噬是一种细胞正常的生理和病理过程，能够降解细胞中非必须的以及紊乱的细胞器和蛋白质，将待降解物质运送到溶酶体中使其降解，当细胞处在有害环境如放疗和化疗时，或者细胞内部发生损伤时，自噬是其中一个非常必要的过程。研究发现化疗能够激活癌细胞的自噬，此过程可能增加癌细胞凋亡或者调控化学治疗药的耐药性，但自噬在宫颈癌中对顺铂的耐药性影响并未完全明确，这也是本研究的重要内容。　　蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)由12种以上的酶组成，这些酶在细胞增殖、分化和凋亡过程中发挥着不同作用。PKC家族在肿瘤发生和发展过程中发挥关键作用，是肿瘤治疗的一个理想靶点。PKCβ是PKC家族中一亚型，PKCβ在顺铂耐药性中的作用还不清楚。顺铂能够激活ROS、DNA损伤、P53、TNFα、MAPKs等多个信号传导过程，在自噬介导的顺铂耐药性过程中涉及的信号通路还不太清晰，自噬与癌细胞凋亡之间联系有待进一步阐明。根据所查文献，我们提出在顺铂治疗宫颈癌过程中PKCβ和自噬可能参与顺铂耐药性。　　目的:　　探索顺铂处理后Hela细胞中PKCβ酶激活情况以及顺铂引起细胞凋亡间的联系。并探索顺铂处理的Hela细胞中自噬所发挥的作用，并通过分析PKCβ信号通路探究PKCβ的激活是否通过自噬影响顺铂的敏感性。　　方法:　　1.将生长良好的Hela细胞接种到六孔板中，分别用0uM、10uM、20uM和50uM浓度的顺铂Hela细胞24小时后收集细胞，提取细胞总蛋白，用Western Blot方法检测Hela细胞中PKCβ和Bcl-2蛋白的表达，并用p-PKCβ抗体检测磷酸化的PKCβ的表达，以GADPH作为内参。20uM的顺铂处理细胞的用0uM或1uM的PKCβ抑制剂恩扎妥林处理Hela细胞系24小时，提取细胞总蛋白用Westren Blot的方法检测细胞中p-PKCβ、PCK、Bcl2蛋白的表达。先将Hela细胞系接种到六孔板中，分别加入0或50uM的顺铂，同时用0uM、1uM、3uM的PKC抑制剂恩扎妥林处理24小时，用ArnexinⅤ-FITC凋亡试剂盒检测各组细胞的凋亡情况并统计凋亡细胞占总细胞数的比例。将顺铂和恩扎妥林处理的hela细胞提取总蛋白，用Western Blot方法检测各组细胞中caspase3和caspase9两个凋亡相关蛋白的表达情况。Western Blot实验中均以GADPH作为内参。　　2.正常Hela细胞进行正常培养，将Hela细胞接板于十二孔板中，过夜培养后，在每孔细胞中用Lipofectine2000转染1ug的EGFP-LC3Ⅱ报告质粒，6小时后换液并分别加入0uM、20uM的顺铂以及0uM、1uM、3uM的恩扎妥林处理细胞24小时，收集细胞进行固定、封片，在荧光显微镜下进行观察，Western Blot的方法检测Hela细胞中内源性LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ表达量的作用。将Hela细胞接种到六孔板中，按照免疫荧光实验的分组进行同样的处理，24小时后收集细胞提取总蛋白进行WesternBlot检验，检测细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和P62的表达，用GADPH作为内参。　　3.将Hela细胞接种到六孔板中，将六组细胞分处理，六组分为:低剂量顺铂单独处理组（用20uM的顺铂处理）、低剂量顺铂和雷帕霉素共处理组(20uM的顺铂和100ng/ml的雷帕霉素共处理细胞)、低剂量顺铂和3-MA共处理组(20uM的顺铂和10uM的3-MA共处理细胞)、高剂量顺铂单独处理组（用50uM的顺铂处理）、高剂量顺铂和雷帕霉素共处理组（50uM的顺铂和100ng/ml的雷帕霉素共处理细胞）、高剂量顺铂和3-MA共处理组(50uM的顺铂和10uM的3-MA共处理细胞)。以上药物处理细胞24小时后进行固定封片，在荧光显微镜下观察拍照，每组随机选取10个视野进行计数统计　　4.为进一步验证自噬对顺铂发挥作用的影响，进一步用流式细胞检测了细胞的凋亡变化　　结果:　　1.在10uM的顺铂刺激下p-PCKβ/p-PCKβ比值较Control组有显著增加（P＜0.05），磷酸化的p-PCKβ增加，20uM和30uM的顺铂处理时，p-PCKβ/p-PCKβ比值增加更为显著(P＜0.001)，定量结果更直观的展现出顺铂对PKCβ磷酸化的促进，激活PKCβ。对Bcl-2蛋白检测结果显示10uM的顺铂对Hela细胞中Bcl-2蛋白的表达并无明显改变，而20uM和50uM的顺铂能够显著抑制Bcl-2的表达(P＜0.01)，在20uM顺铂处理时，Bcl-2蛋白表达量降至Control组的一半以下。　　2.四组细胞中顺铂能够明显促进p-PKCβ/PKCβ的比例促进PKCβ的磷酸化激活(P＜0.001)，但是加入恩扎妥林后能够明显抑制p-PKCβ/PKCβ比例的增加(P＜0.001)，将磷酸化PKCβ的比例下降到接近Control组的水平。恩扎妥林单独处理组Bcl-2表达量与Control组相比并无明显差异，但是恩扎妥林和顺铂共处理组Bcl2蛋白表达得到一定程度的回升(P＜0.01)，表达量约为顺铂单独处理组的1.5倍左右，恩扎妥林能够显著的抑制顺铂造成的Hela细胞中Bcl2表达量下降。顺铂单独处理时Cleaves/PRO caspase3的表达量比Control组增加了近7倍（P＜0.0001），而高剂量和低剂量的恩扎妥林都能够抑制顺铂造成的Cleaves/PRO caspase3增加现象，尤其是高剂量恩扎妥林处理后Cleaves/PRO caspase3降低了1倍以上(P＜0.001)。Caspase表达的实验结果与流式细胞实验以及Bcl-2表达量实验结果相一致。　　3.在高剂量恩扎妥林和顺铂共处理组，LC-3Ⅱ荧光点数量最多，每个细胞中约有125个，低剂量的恩扎妥林和顺铂共处理组每个细胞中也有超过50个点状聚集，和Control组以及顺铂单处理组相比有显著差异(分别为P＜0.00001和P＜0.0001)。免疫荧光实验的结果显示，高剂量和低剂量的恩扎妥林均能够诱导顺铂诱导的Hela细胞中细胞自噬现象。我们检测了四组细胞中P62的表达，顺铂单独处理组P62表达有一定程度的增加，而高剂量和低剂量的恩扎妥林能够使细胞中P62的表达大量积累。P62蛋白表达量的定量结果，以GAPDH表达作为内参，结果示，顺铂单独处理组细胞中P62表达量有一定程度的增加(P＜0.05)，而高剂量和低剂量的恩扎妥林处理后P62表达量显著增加(分别为P＜0.0001和P＜0.001)。　　4.Westrn Blot方法检测LC-3Ⅱ和LC-3Ⅰ以及自噬相关基因5（autophagyassociated gene，Atg5）的表达，高剂量顺铂处理的细胞中LC-3Ⅱ和Atg5蛋白表达量较高，尤其是雷帕霉素共处理组，最为明显，3-MA处理后自噬相关蛋白Atg5和LC-3Ⅱ均受到抑制，3-MA和高剂量顺铂处理组LC3-Ⅱ/LC3-L的比值显著降低(P＜0.05)。对Atg5的定量结果也一致，高剂量顺铂和雷帕霉素共处理组Atg5的表达量最高(P＜0.01)，3-MA和高剂量顺铂处理组Atg5的表达量显著降低(P＜0.01)。流式细胞结果的定量图表示在单纯转染对照质粒的对照组中凋亡细胞数占细胞总量的10％左右，与之前实验中无处理组10％的比例接近，在单纯过表达PKCβ总蛋白后，凋亡细胞数仍占细胞总量的10％左右与Control组相比无差异。顺铂处理细胞后，凋亡细胞数占细胞总量的30％，增加明显，而在过表达PKCβ并加入顺铂处理后，凋亡细胞数占细胞总量的比例增加到40％以上与单纯的顺铂处理组相比有显著差异(P＜0.05)。　　结论:　　1.顺铂能够促进Hela细胞中凋亡并伴随着PKCβ磷酸化激活。　　2.抑制PKCβ磷酸化活化能够降低顺铂对Hela的细胞凋亡作用。　　3.抑制PKCβ能够增加顺铂诱导的Hela细胞的自噬程度。　　4.自噬激活后可下调Hela细胞对DDP的敏感程度。　　5.过表达PKCβ能够降低顺铂诱导的细胞自噬促进Hela细胞凋亡。