甜菜夜蛾是蔬菜等作物上的重要食叶性害虫,长期以来单一依赖化学杀虫剂进行防治,致使该害虫已对有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等传统杀虫剂以及氯虫苯甲酰胺、茚虫威、氰氟虫腙等新型杀虫剂产生高水平的抗药性。氰氟虫腙是新型钠离子通道阻断剂,被认为是替代传统药剂的良好品种,但甜菜夜蛾对氰氟虫腙的抗药性水平与机制研究尚不充分。本论文以调查甜菜夜蛾对氰氟虫腙的抗药性机制为目的,首次发现广东惠州甜菜夜蛾对氰氟虫腙产生高水平抗药性,黄素单加氧酶（FMO）参与氰氟虫腙的生化抗性这一新型抗药性机制。通过对甜菜夜蛾FMO的分子特征、敏感/抗性种群中酶活性和mRNA表达水平、体外表达及对杀虫剂的代谢活性进行研究,证实了甜菜夜蛾FMO与氰氟虫腙的生化抗性有关。在调查电压门控钠离子通道（VGSC）与氰氟虫腙靶标抗性过程中,由于未能成功获得甜菜夜蛾VGSC全长序列,最终选择模式生物黑腹果蝇的VGSC进行体外表达,系统研究VGSC转录本的药敏性、基因突变对VGSC门控特性和药敏性影响,增进了对氰氟虫腙靶标蛋白与杀虫剂抗药性的理解。1 甜菜夜蛾对氰氟虫腙的代谢抗药性采用浸叶法测定了广东惠州种群甜菜夜蛾在2011和2012年分别对氰氟虫腙产生了 922倍的极高水平抗药性和60倍的高水平抗药性。增效剂试验显示,酯酶抑制剂DEF对HZ11、HZ12种群的增效倍数分别为5.7,3.4倍;黄素单加氧酶（FMO）抑制剂MEM对HZ11、HZ12种群的增效倍数分别为3.1,1.9倍;而细胞色素P450的抑制剂PBO和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的抑制剂DEM发挥的作用不明显。解毒酶活性测定发现,酯酶、FMO在HZ12种群的活性显著高于Lab-sus（2.8、1.4倍）,并在氰氟虫腙室内筛选种群（HZ-meta）中进一步升高,分别达到Lab-sus的3.4和1.5倍。HZ12种群的P450活性与Lab-sus相比没有显著差异,但是HZ-meta种群的P450活性显著提升,而GST在抗性种群中的活性与Lab-sus相比没有差异。因此,发现酯酶在惠州种群的甜菜夜蛾对氰氟虫腙的生化抗药性中起主要作用,FMO也参与其中,P450可能发挥一定作用,而GST没有参与其中。2 FMO的分子结构与表达特性利用PCR-RACE技术扩增获得3个甜菜夜蛾FMO基因（SeFMO）全长序列,其中SeFMO1全长1837bp,编码454个氨基酸;SeFMO2全长2277bp,编码453个氨基酸;SeFMO3全长1617bp,编码431个氨基酸。序列分析显示SeFMO具有FMO的基本结构域,即:FAD结合位点、NADPH结合位点以及FMO识别序列。系统进化分析显示出鳞翅目的FMO1、FMO2由相同祖先进化而来,而鳞翅目FMO3与直翅目、双翅目昆虫的FMO基因聚为一支。利用实时荧光定量PCR检测了 SeFMO mRNA的表达模式,结果显示SeFMO mRNA具有组织特异性表达和发育阶段特异性表达的特点,在中肠、脂肪体、马氏管和高龄幼虫中表达水平较高。FMO微粒体酶活性测定结果与mRNA表达水平对应,在中肠和脂肪体中活性相对较高;同时,FMO的活性随幼虫发育时期增加而升高,在5龄幼虫中活性达到最高（4.814nmol/min/mgprotein）。用11种杀虫剂对甜菜夜蛾脂肪体细胞在体外进行胁迫处理,24h后观察到一些杀虫剂使SeFMOm RNA的表达水平微弱上调,说明SeFMO基因mRNA的表达能够被外源杀虫剂诱导。由于昆虫未见FMO活性测定的详细报道,优化了甜菜夜蛾FMO微粒体酶活性测定的最佳条件:最适pH为9.0,最适温度分别35℃,反应体系中总蛋白浓度为0.05-0.2mg/mL,在第5-15分钟进行检测。体外重组FMO纯酶液的最适温度和最适pH 8.5-9.0以及37℃,与微粒体酶液的结果具有相同趋势。3 FMO与氰氟虫腙抗药性的关系通过一系列研究证实FMO与氰氟虫腙抗药有关。首先,在HZ-Meta种群中,FMO酶活性显著高于HZ12原始种群。HZ-Meta种群中SeFMO mRNA表达水平在绝大部分发育时期和主要代谢器官中都显著高于敏感种群中的mRNA表达量。氰氟虫腙对SeFMO表达量具有微弱的诱导作用,对SeFMO1、SeFMO2的诱导倍数分别为1.6和1.5倍。因此,发现FMO活性升高与氰氟虫腙抗药性有关。其次,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统体外表达了 SeFMO蛋白。采用NADPH氧化法,测定了 rSeFMO纯酶液对19种化合物的酶活性。rSeFMO蛋白的S-氧化活性高于N-氧化活性,rSeFMO1-3对N-氧化底物DMA的活性分别为1.99、2.07 和 4.22 nmol/min/mg protein;对 S-氧化底物 MEM 的活性分别为 5.83、4.14 和 4.98 nmol/min/mg protein。rSeFMO 对氰氟虫腙的活性（8.05、19.09 和 12.19 nmol/min/mg protein）和高效氯氟氰菊酯的活性（9.60、6.98 和 6.44 nmol/min/mg protein）高于对模式底物的活性。rSeFMO对其他杀虫剂的活性相对较低,基本在 1-3 nmol/min/mg protein 之间。重组FMO活性测定结果表明,SeFMO对杀虫剂、特别是氰氟虫腙具有代谢活性,是重要的解毒代谢酶,认为FMO对氰氟虫腙的代谢活性与氰氟虫腙抗药性有关。4 黑腹果蝇VGSC不同转录本的药敏性差异系统地对模式昆虫黑腹果蝇电压门控钠离子通道（VGSC）的功能和特性进行研究。采用点滴法进行生物测定,结果显示W1118品系黑腹果蝇系对6种杀虫剂的敏感性为:四氟苯菊酯>四氟甲醚菊酯>甲氧苄氟菊酯>溴氰菊酯>氯菊酯>DDT,LD50 分别为 0.059,0.094,1.37,2.62,9.37 和 56.99 ng/头。在非洲爪蟾卵母细胞中表达了黑腹果蝇29个钠通道转录本,通过双极电压钳技术记录到相关钠离子电流。测定了黑腹果蝇29个钠通道转录本对新型拟除虫菊酯杀虫剂四氟苯菊酯和甲氧苄氟菊酯的敏感性。DmNav22对两种药剂的敏感性最高,分别为89.34%和38.25%。大部分钠通道转录本对四氟苯菊酯的敏感性高于对甲氧苄氟菊酯的敏感性,与生物测定结果相对应。不同钠通道转录对同一种药剂的敏感性具有较大差异,敏感型转录本比例低于相对抗性的转录本比例。黑腹果蝇钠通道不同转录本对杀虫剂的敏感性分析,补充了对氰氟虫腙的靶标VGSC药敏性特点的理解。5 11545M与G1571R突变介导的VGSC抗药性昆虫VGSC上的基因突变是导致杀虫剂抗药性的重要原因。黑腹果蝇低温敏感性突变品系Ocd5对DDT产生了 1000倍以上的极高水平抗性,在VGSC上检测到两个与抗药性有关的突变I1545M和G1571R。利用定点突变技术,将I1545M、G1571R以及I1545M/G1571R双突变引入野生型黑腹果蝇钠通道DmNav2-4中,进行爪蟾卵母细胞体外表达。DmNav2-4在激活时V1/2与斜率k分别为-18.9±0.3 mV和3.8±0.2 mV;快速失活的V1/2与斜率k分别为-44.9±0.2 mV和4.8±0.3 mV。11545M突变影响了钠通道的激活（V1/2=-7.8±0.2 mV）与快速失活（V1/2=-48.7±0.3 mV）,G1571R突变影响了钠通道的快速失活（V1/2=-49.3±0.3 mV）,而双突变体也同时改变了激活（V1/2=-5.0±0.5 mV）与快速失活过程（V1/2=-53.7±0.2mV）。I1545M和G1571R突变能够减弱DDT对钠通道失活电流的抑制作用和钠通道重复放电程度,双突变进一步增强了这种效果。同时,I1545M和G1571R突变在3种浓度下都降低了氯菊酯和溴氰菊酯对钠通道的修饰程度,双突变更加提升了对钠通道对氯菊酯和溴氰菊酯的抵抗能力。因此,证实I1545M与G1571R突变显著降低了黑腹果蝇VGSC的药敏性,导致VGSC对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗药性。