论文部分内容阅读
再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA)是一种由T细胞异常活化引起的以造血组织为靶细胞的特殊的自身免疫性疾病,T细胞的异常活化可能与共刺激分子表达及功能异常有关。目的:研究协同刺激分子PD-1 (Programmed Death-1)对再生障碍性贫血中T细胞异常调节的作用及其机制;观察川芎嗪治疗的再生障碍性贫血患者T细胞PD-1和sPD-1的变化及体外川芎嗪对T细胞增殖和细胞因子分泌的影响。方法:1)、应用两株识别位点不同的鼠抗人PD-1分子单克隆抗体1F2和5F10,采用1F2作为包被抗体,5F10经生物素(biotin)标记后作为检测抗体,建立双单抗夹心的人可溶性PD-1(sPD-1)酶标检测方法,并对健康供血员、血液病患者及移植等病人血清中sPD-1的含量进行了检测。2)、应用流式细胞技术检测AA患者外周血和骨髓中CD4+和CD8+T细胞表面PD-1的表达;并用自主研制的sPD-1 ELISA试剂盒,检测临床AA患者血清中sPD-1含量,观察sPD-1在体外对T细胞增殖和IL-2和IFN-γ分泌的影响,并应用Real-time PCR检测AA患者血清中不同PD-1剪辑的转录产物的表达水平。3)、观察2例临床应用川芎嗪治疗1个月的再障患者治疗前后的T细胞表面标记PD-1、CD4、CD8、CD25和血清中sPD-1表达水平的变化。应用MTT法检测体外实验中川芎嗪对正常人和AA患者外周血T细胞增殖的作用;应用流式细胞术检测川芎嗪对CD4+和CD8+T细胞上CD25 (IL-2R)的表达及PD-1表达的影响;应用ELISA法检测细胞因子IL-2、IFN-γ和sPD-1的水平变化。结果:1)、成功研制了人sPD-1酶联检测试剂盒,用该试剂盒测得血清中sPD-1的正常值为1.103±0.240ng/ml,AA患者血清中sPD-1的含量明显高于正常对照组,而甲亢和器官移植病人血清中sPD-1的含量和正常值相比没有显著差异。2)、流式结果显示,AA患者外周血和骨髓中CD4+和CD8+T细胞低表达PD-1,而ELISA结果显示,血清中高表达sPD-1;Real-time PCR结果显示,sPD-1可能是PD-1Δex3变异体的转录产物;且此sPD-1能上调T细胞增殖和细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌。3)、临床川芎嗪治疗2例有效病例结果表明,川芎嗪能上调T细胞上CD4、下调CD8、CD25分子以及血清中sPD-1的表达水平。川芎嗪体外能明显抑制正常的和AA患者T细胞的增殖和活化,并降低IL-2和IFN-γ的水平,能抑制CD4+和CD8+T细胞上CD25的表达,能上调AA患者T细胞上PD-1的表达以及降低上清中sPD-1的表达水平,对正常人T细胞上PD-1作用不明显。结论:AA中T细胞的异常活化与PD-1分子和功能的异常有关,其作用机制可能是:PD-1Δex3的转录产物sPD-1在AA患者血清中的高水平表达,导致sPD-1作为一种与PD-L特异性结合的自身抗体,从而阻断PD-1/PD-L的信号通路,上调T细胞的活化增殖和细胞因子的分泌,增强了T细胞对造血细胞的毒性以及造血抑制因子IFN-γ对造血细胞的作用,最终导致AA的发生。川芎嗪治疗AA的可能机制是:川芎嗪对免疫过激T细胞具有一定的抑制作用,其对T细胞的免疫抑制作用可能与降低IL-2和IFN-γ的分泌、抑制IL-2R(CD25)的表达和降低患者血清中sPD-1的表达水平有关。此研究发现为进一步理解再障的病因、治疗和预后监测提供了实验基础,为寻找免疫干预的新靶点提供了理论依据,为进一步解释川芎嗪应用于再障治疗提供了理论依据。