随着生物技术的蓬勃发展,利用微生物发酵生产番茄红素受到越来越多人的关注。在众多产番茄红素菌株中,三孢布拉霉(Blakeslea trispora)是主要的番茄红素工业生产菌株,B.trispora是一种接合真菌,分为正(+)菌和负(-)菌,只有两种不同性别的菌株混合发酵才能大量产生番茄红素。其中负菌是番茄红素的主要产生菌,正菌作为配对菌与负菌共同发酵,从而极大的促进了番茄红素的合成。普遍认为,负菌单独培养时,性激素三孢酸的缺乏是负菌不能大量合成番茄红素的主要原因。虽然关于三孢酸的报道很多,但是在三孢酸存在的情况下,上调和下调基因有哪些,又有哪些差异表达基因与番茄红素的合成有关,即三孢酸调控番茄红素合成的机制并不完全清楚。因此,本研究利用转录组学技术分析三孢酸刺激下负菌基因表达量的差异,确立了受三孢酸刺激的关键代谢途径及候选基因,并对其中编码5α还原酶的基因redY进行了深入分析,具体如下:(1)三孢酸对B.trispora(-)番茄红素合成的影响。本研究选取影响三孢酸提取的两个关键因素—皂化剂和有机萃取剂进行了优化,调查不同浓度的三孢酸对番茄红素产量的影响,分析三孢酸添加后培养的时间与番茄红素合成途径上关键基因表达量的关系。结果表明,以碳酸钠作为皂化剂,以含有5%异丙醇的三氯甲烷作为有机相的萃取效率最高。在发酵液中三孢酸的含量为24μg/L时,番茄红素产量最高。在添加三孢酸后的第6 h,关键基因表达量差异最为明显。(2)基于转录组学技术分析三孢酸刺激B.trispora(-)高产番茄红素机理。使用BGISEQ-500平台,对添加三孢酸培养的B.trispora(-)和未添加三孢酸培养的B.trispora(-)进行转录组测序,共获得1026个显著差异的基因,其中上调基因487个,下调基因539个。差异基因GO和KEGG富集分析表明,三孢酸对B.trispora(-)的萜类化合物合成途径、脂肪酸降解途径、不饱和脂肪酸合成途径、类胡萝卜素合成途径、氨基酸降解途径等有着显著的影响。注释到的差异基因中sexM、SOX5和5α还原酶编码基因与三孢酸代谢调控机制有着密切相关,它们作为候选基因用于进一步的研究。(3)5α还原酶的编码基因-redY的功能探究。转录组分析所得到的候选基因中,编码5α还原酶的基因首先引起了我们的关注。由于该基因在真菌中尚未有报导,在本研究中命名为redY。向发酵过程中添加redY基因产物抑制剂-度他雄胺以及其涉及代谢途径的终产物-芸苔素内酯,并运用分子生物学手段使redY基因在B.trispora(-)中过表达来探究基因功能。结果表明度他雄胺、芸苔素内酯等都能明显抑制三孢酸对三孢布拉霉的刺激作用,降低番茄红素的合成。当三孢酸存在的时候,redY基因过表达会刺激sexM、carRA、carB基因的表达,而没有三孢酸存在时,redY基因过表达只能刺激sexM基因的表达,而对carRA、carB基因的表达量没有影响。