单核-巨噬细胞是机体固有免疫系统的组成部分,在清除病原体、抗感染免疫、组织修复及抗肿瘤等方面发挥重要作用。单核-巨噬细胞来源于髓系干细胞,具有功能多样性和表型可塑性。巨噬细胞是机体抵抗病原体入侵的第一道防线,但处于不同微环境刺激下的巨噬细胞会对自身的功能特性进行重新编程从而获得不同的表型。巨噬细胞的极化就是根据不同的功能表型进行划分。干扰素(IFNs)、Toll like receptor通路或者IL-4/IL-13通路分别诱导巨噬细胞发生M1或者M2极化。鉴于巨噬细胞本身强大的功能以及在免疫过程中的重要作用,调控巨噬细胞极化的防治策略已成为感染性疾病、炎症性疾病和肿瘤治疗的新兴领域。在第一章,我们综述了巨噬细胞极化、炎症小体、自噬在炎症性疾病中的作用,以及三者之间的关联。在此基础上,我们开展了调控巨噬细胞功能的小分子化合物研究,并就其作用机制进行深入探讨。在第二章,我们筛选了六种九里香提取分离的单体化合物,发现一种二氢黄酮醇类结构化合物,Mur04,具有针对于巨噬细胞的抗炎作用。该化合物显著抑制脂多糖活化的巨噬细胞IL-1beta、IL-6mRNA水平,而对静息状态的正常巨噬细胞株以及腹腔巨噬细胞没有毒性作用。随后,我们考察Mur04对巨噬细胞功能的影响。首先,建立巨噬细胞极化模型,考察Mur04对巨噬细胞极化的作用。结果表明,Mur04能够抑制M1巨噬细胞释放的特征性炎症因子IL-1beta、IL-6、 TNF-alpha、NO,降低其表面marker CD11c的表达,另一方面,Mur04升高M2巨噬细胞特征性因子Fizz1、Ym1、CD206的mRNA水平；进一步研究表明,Mur04抑制M1极化的STAT1通路,下调p-STAT1、IRF5的表达,增强M2极化通路,上调p-STAT6、SOCS1、IRF4的表达；随后,我们建立了巨噬细胞极化中间状态的模型,该状态巨噬细胞与Mur04共孵后,IL-1beta、IL-6mRNA水平显著下调,同时CD206的mRNA水平显著上调,再次表明Mur04具有抑制M1极化、促进M2极化的功能；两种小鼠sepsis模型证实了Mur04的体内抗炎作用。Mur04显著提高LPS以及盲肠穿刺结扎(CLP)诱导的sepsis小鼠存活率,减缓小鼠体重降低速度,降低血清促炎因子IL-1beta、TNF-alpha水平,明显改善肝脏、肺脏的病变。巨噬细胞向M1极化的过程伴随炎症小体的活化。Mur04显著抑制M1的极化,因此我们检测Mur04是否影响炎症小体的活化。结果表明,Mur04显著下调IL-1beta的分泌,抑制caspase-1的剪切形式,说明化合物Mur04抑制炎症小体的激活。自噬则是细胞通过双层膜结构的自噬小体包裹胞浆成分,包括细胞内损伤的细胞器或者病原体,运送到溶酶体降解。自噬通路和固有免疫以及适应性免疫的很多方面密切相关,然而关于自噬和TLR通路的确切关系还存在很大争议。自噬对炎症小体具有负调控作用,机制在于自噬介导损伤线粒体的清除,自噬缺失的细胞内积累损伤的线粒体,进而产生大量的ROS,线粒体DNA释放进入胞浆,从而引发NLRP3炎症小体的活化。因此我们继续检测Mur04对细胞自噬是否有影响。实验结果表明,Mur04促进Beclin1、LC-3BII的表达水平,MDC染色增强。在第三章,基于前面的实验结果,Mur04抑制巨噬细胞M1极化,抑制炎症小体活化,促进细胞自噬,我们进一步检测自噬、极化、炎症小体之间的调控机制。自噬负调控炎症小体的活化,我们的实验也支持这一结果。巨噬细胞极化状态不同,自噬水平也存在很大差异：M1型巨噬细胞LC-3BⅡ表达量显著高于M2,MDC染色也证实了这一结果。这暗示着自噬和巨噬细胞的极化状态有关联。接下来,我们构建了ATG6(beclinel)干扰的THP-1细胞株,探究自噬与巨噬细胞极化之间的调控关系。结果显示,ATG6-siRNA Ml型巨噬细胞相关炎症因子IL-1beta. IL-6、TNF-alpha mRNA水平降低,M2型巨噬细胞炎症因子TGF-beta升高,即干扰自噬,促进细胞向M2极化。Mur04对ATG6-siRNA THP-1细胞炎症小体活化的抑制作用减弱,证实Mur04通过调控自噬作用于炎症小体。和自噬抑制剂3MA联合使用的实验结果也证实了这一论断。Mur04与自噬激动剂Rap联合使用与化合物单独作用没有显著差异,可能是因为二者作用方向相同,细胞的M1的极化已经接近本底水平,所以联合使用没有再降低的空间。动物实验与细胞实验结果一致。小鼠腹腔注射脂质体剔除巨噬细胞后注射LPS诱导sepsis。分化成熟的BMDM极化过程中分别加入自噬调控剂以及Mur04,极化结束后转输到小鼠体内。结果显示,3MA处理的细胞转输到小鼠体内后小鼠存活率降低,Rap、MurO4组小鼠存活率升高。3MA、MurO4联用组小鼠存活率比单独3MA处理组高。然而,自噬调控极化的机制仍需要进一步的实验研究。前面的实验过程中,我们发现Mur04降低IRF5的表达量,从而抑制细胞的M1极化。细胞内蛋白的主要降解途径为泛素化介导的溶酶体降解。我们的实验结果也表明,M1型巨噬细胞存在较高水平的泛素化。Mur04的作用下的M1型巨噬细胞,IRF5泛素化水平增高。然而,Mur04的作用下ATG6-siRNA THP-1细胞IRF5泛素化水平与NC-siRNE汗扰组相比明显减少。说明Mur04诱导的IRF泛素化降解需要自噬的参与。综上所述,本课题通过对九里香提取物Mur04的抗炎活性研究,从调控巨噬细胞极化和炎症小体入手,发现了化合物Mur04,显著抑制巨噬细胞M1极化,并抑制炎症小体活化,改善小鼠脓毒症模型,具有良好的炎症性疾病的治疗作用；借助于Mur04的功能,通过发现自噬调控巨噬细胞极化这一新现象,并进一步确定自噬是通过诱导IRF5的泛素化降解从而抑制巨噬细胞M1极化这一新机制为调控巨噬细胞功能提供了新的方向。然而,本课题也还存在一些不足,例如Mur04如何激活细胞自噬,IRF5泛素化降解的具体分子机制等还需要进一步的实验支持。