流行性感冒,简称流感,是地球上分布最广、历史最悠久的一种急性人畜共患传染病。其病原体为流感病毒,属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)。是一种分节状负义RNA病毒,只能于感染的宿主细胞内繁殖。　　 神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)是流感表面重要抗原物质之一,与流感病毒表面蛋白血凝素(Haemagglutinin,HA)共同为流感病毒传播致病的重要物质基础和其亚型分型的重要依据。其主要功能为促进子代病毒从宿主细胞表面释放,并阻止子代病毒的自我聚集进而感染其他细胞。而且该酶是扎那米伟Zanamivir)和奥司他韦(Oseltamivir)等主要抗流感药物的作用位点。神经氨酸酶遗传进化的分析研究对流感病毒的防治有重要意义。　　 本研究在河南省甲型H1N1流感爆发的2009年10月至12月间于河南省流感哨点医院采集流感样病例毒株样本200例,经培养、分型、基因扩增和测序对得到的病毒基因样本进行比对,分析河南省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的变异情况,了解其变异现状及特点。　　 材料和方法：　　 1.流感病毒样本的采集2009年10月至12月于河南省流感哨点医院,选择未服用抗病毒药物、发病头三天的患者采集流感样病例采集流感临床标本。制成病毒鼻咽试子,4℃条件下24h内送至实验室。　　 2.流感病毒分离培养技术　　 2.1病毒培养用MDCK细胞制备用含10％HEPES和10%胎牛血清DMEM培养液培养MDCK细胞。于37℃,5%CO2培养箱中培养。　　 2.2流感病毒分离流感病毒分离选用处于对数期生长且75%～90%成片的MDCK细胞。1mL病毒鼻咽试子接种,用含10%HEPES和10%胎牛血清DMEN培养液,并使用终浓度为100U/mL、100μg/mL的青、链霉素双抗。于35℃温箱培养7天,观察细胞形态。进行红细胞凝集试验(HA),将HA滴度小于8的毒株进行传代培养,直至滴度大于8。　　 3病毒亚型鉴定　　 3.1血凝试验用0.75%人"O"血细胞悬液进行血凝试验,以中国CDC提供的标准病毒样本A/四川/SWL1/2009(H1N1)做阳性对照,用同体积的PBS做阴性对照。以出现凝集的最高稀释倍数为重点计数,其稀释倍数的倒数为其血凝滴度。　　 3.2血抑实验用含4个血凝单位25μL病毒液进行血抑实验,用国家标准抗A(H1N1)、抗A(H3N2)、抗B型Yamagata系、抗B型Victoria系和抗新甲型H1N1五种病毒抗体血清进行测定,以红细胞凝集出现时血清的最高稀释倍数的倒数为红细胞凝集抑制效价,当其大于等于20且仅于一种抗体血清发生反应时确定为阳性。　　 4 NA基因全长引物设计采用中国国家流感中心提供的引物序列,对相应的引物库筛选,选择2对引物,预计扩增产物片段长度为引物对1:1064bp,引物对2:728bp。测序引物序列每条正反向引物前面分别加上-tgt aaa acg acg gccagt和-cag gaa aca get atg acc,由上海生物工程技术有限公司合成。　　 5病毒RNA提取与cDNA制备采用Rneasy Mini Kit提取病毒总RNA,采用荧光定量PCR进行鉴定,采用One step RT-PCR试剂盒RNA Protecter作为RNA酶抑制剂一步扩增目的cDNA。RT-PCR扩增步骤:50℃逆转录30 min,94℃失活逆转录酶2 min,并同时启动热启动DNA聚合酶,94℃变性30s,52℃退火45s,65℃延伸1.2 min,共40个循环,然后65℃保持10 min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶110V电压电泳30min,紫外荧光显色定性。　　 6目的基因测序和序列分析扩增出的cDNA产物由上海生工生物公司纯化测序,用contigexpress软件对测序结果进行序列拼接。用BLAST比对扩增产物,看有无相同序列。进而与2009年出现的甲型H1N1流感进行比对分析,选取国内外代表株,对其核酸和氨基酸序列进行比对。采用分子进化遗传分析软件(Vector NTI Suite7)Align X法绘制进化树。　　 结果：　　 1病毒亚型鉴定结果　　 哨点医院送检200例样本经鉴定,共获得35株河南省新甲型H1N1病毒样本,血凝抑制试验滴度均大于20,且不与其它抗体血清发生反应。　　 2 One step RT-PCR扩增结果　　 35株病毒样本两组引物扩增结果于1100bp和700bp附近均出现明显条带的样本20例,仅扩增出700bp条带的毒株5例,其他未扩增出明显条带。　　 3测序结果　　 送检的20例基因样本共计有17例得到测序结果(GenBank序列号:JN036561-JN036577)。Contigexpress软件进行序列拼接后比对。　　 4测序比对结果　　 本次河南分离株与2009年以后分离得到的甲型H1N1流感分离株相似性较高,均在99%以上。　　 与国内代表株(GQ166224)和国际疫苗株(FJ984386)比较,本次毒株神经氨酸酶基因主要有6处变异,包括:316位G/A变异(17/17);408位A/G变异(3/17);742位A/G变异(17/17);945位A/G变异(14/17);1305位A/G变异(4/17):1338位T/C变异(11/17)。其中,本次分离株316位742位核酸,均发生变异,分别导致氨基酸序列106位V/I和248位N/D替换。这两个位点均为NA蛋白抗原位点,且248位N/D突变导致氨基酸电性发生改变。其他4处突变均为同义突变,对氨基酸序列无影响。　　 5通过BLAST分析结果　　 2009年10月以后,在我国以及世界各地,发现NA基因316位G/A和742位A/G(N端106位V/I和248位N/D)变异株;同时,发现我国多个省份和亚洲其它多个地区病毒株NA基因存在945位A/G和1338位T/C突变。　　 945位A/G和1338位T/C突变两个变异位点同样发现于我国2009年香港(CY061751 CY061759)和2010年南昌(JF275935 JF275927 JF275919)猪流感中,这些序列是分离自猪感染人甲型H1N1流感病毒,并在猪体内得到重组以后的序列,且与2009年河南分离株NA基因相似性达99.9%。　　 6进化树分析结果　　 进化树显示主要分为两大聚类:聚类Ⅰ中本次分离株含945位A/G和1338位T/C突变的.A/Qingfeng/SWL43/2009(H1N1)和A/Hualon/SWL1313/2009(H1N1)与国内部分地区(四川等)、俄罗斯赤塔地区、2010年泰国地区甲型H1N1流感以及国内猪流感亲缘较近,这一聚类均包含945位A/G和1338位T/C突变。　　 聚类Ⅱ中945位和1338位未变异的A/Ruzhou/SWL564/2009(H1N1)和2009-2011国际疫苗株亲缘性更接近于欧美地区和2009年东南亚和中国大部分地区分离株。　　 国际代表株A/California/07/2009(HlNl)与国内代表株A/Sichuan/1/2009(H1N1)和2009年5月北京分离株A/Beijing/01/2009(H1N1)为聚类Ⅱ中一小聚类,这一聚类为2009年甲型H1N1流感暴发初期得到的代表性序列,没有发现蛋白序列106位V/I和248位N/D变异。进化树中除这一小聚类外,其他毒株这两位点均发生变异,其中多株毒株为2009年6至8月间发布的毒株序列如:日本、挪威、中国上海、中国浙江等地分离株。　　 结论：　　 1本实验共得到的17株河南省甲型H1N1病毒神经氨酸酶基因CDS全长序列,结果已上传至GenBank。　　 2河南省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因抗原区氨基酸有两位点发生变异(106 V/I,248N/D)。248N/D变异对以往季节性流感神经氨酸酶抗体有一定影响。　　 3由输入型甲型H1N1流感病毒病例到以本土传染为主的流行时间内,中国有可能存在着猪——人之间相互传染。