中国东海微生物来源新聚酮合酶基因簇/基因片段的筛选及其新酰基转移酶结构域的功能研究聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)催化产生多种类型的聚酮化合物及其复杂的衍生物,其中部分化合物具有重要的药理学活性。分离、表达这些合成生物活性化合物的新PKS成为生物技术药物研究领域的重点。另外,PKS由于其结构上的特点更成为研究开发组合生物合成药物的理想材料。但是目前已知的PKS数量限制了这些研究深入进行,研究者需要更多的新PKS基因簇序列来充实PKS数据库,以期从中分析获得更多的信息。 本研究提取了中国东海海洋沉积物样本的宏基因组DNA,从中通过简并PCR分离得到了26条新PKS基因片段,并进行了进化分析,推测了它们的来源菌株；通过构建海泥宏基因组DNA文库,用探针筛选得到了1个长度为7981 bp的PKS部分基因簇,并通过数据库和生物信息学软件对其基因结构进行了解析；在体外通过底物结合实验推测出其中1个新酰基转移酶(acyltransferase,GenBank登录号EF080951)的底物特异性；avermectin合成酶系基因簇中PKS基因簇的aveA1基因中模块2编码的AT2(3)结构域用AT-EF080951结构域通过DNA同源重组替换掉,检测突变株产物的变化,在体内进一步分析了AT-EF080951结构域的底物特异性。 通过以上研究我们初步建立了新PKS基因簇分离、结构解析、功能研究的技术平台,通过底物结合实验和结构域替换实验鉴定了1个新酰基转移酶的功能,为进一步的聚酮化合物组合生物合成研究打下基础。 一、海洋沉积物样本宏基因组DNA的提取 海洋微生物资源丰富,大部分微生物属于人类未知的品种。本研究即选择海洋沉积物为材料,2005年9月于中国东海洋山港东南1km处,约10m深度海底不同地点采集沉积物样本M1、2、3、4、5各约10ml。 通过微生物学分离和培养操作分析各样本中的微生物种群丰富度,选取丰富度最高的样本M1提取DNA。由于海洋沉积物成分复杂,传统的方法(如苯酚/氯仿法)提取其中DNA比较困难,本研究中采用了Mo Bio公司的土壤DNA抽提试剂盒提取海洋沉积物中总DNA,并在实验中加以改进。 抽提得到的总DNA通过脉冲场电泳鉴定长度；通过紫外分光光度法测定浓度：设计了细菌16S rDNA引物,以总DNA为模板进行PCR扩增,检验是否抑制PCR反应。 二、简并引物设计和筛选酮缩酶基因片段 酮缩酶(ketosynthase,KS)结构域在PKS酶系中功能和序列保守,适合设计简并引物。引物设计方法参考Rose等提出的CODEHOP PCR(consensus-degeneratehybrid oligonucleotide primers PCR)。通过NCBI的Conserved Domains Database找出保守并适合设计CODEHOP引物的蛋白模序DPQOR和HGTGT,两个模序之间对应的核苷酸在600～900 bp之间,针对它们各设计若干条引物并两两配对,共计112对引物。 PCR筛选实验以第一部分中提取的宏基因组DNA为模板。由于目的DNA片段的GC含量较高(多为80％以上),PCR反应缓冲液选用Takara公司的GC buffer。符合理论长度的阳性PCR扩增片段回收、连接入测序载体pMD18-T送公司测序,结果与GenBank数据库比对,确认是否目的DNA片段。PCR扩增共得到15条阳性片段,其中3条为新KS基因片段,至此本课题组共从海洋沉积物样本中获得26条新KS基因片段。 通过比对这些KS基因片段的蛋白序列,构建出进化树系图将它们分为两大PKS基因簇类群:Ⅰ型KS基因片段和来自杂合PKS/NRPS基因簇的KS基因片段；并且分析出这些片段的可能来源菌属种类为放线菌门、δ变形菌纲、蓝细菌门和β变形菌纲。 三、海洋沉积物样本宏基因组文库的构建及PKS基因簇分离 简并PCR虽然可以有效地分离新PKS基因片段,但是无法获得全基因簇。而构建宏基因组DNA文库则可以解决这个问题。根据统计现在已经发现的PKS基因簇大小大部分低于50 kb,本研究选用Epicentre公司的fosmid文库构建宏基因组文库,其容量20～50 kb,符合PKS基因簇筛选的条件。构建文库的模版即为第一部分中提取的海洋沉积物样本Ml的宏基因组DNA。文库构建中也对其方法进行了改进。 通过实验和公式计算出文库的滴度,按照预计密度进行铺板；文库菌落转移到硝酸纤维素膜上；用第二部分中分离得到的KS基因片段DQ924531作为探针,以DIG标记后对硝酸纤维素膜上的菌落进行Southern杂交,化学显色；阳性克隆提取质粒测序,得到1个7981 bp的PKS部分基因簇(GerdBank登录号EF568935),但是由于其自身频繁的高级结构和测序条件的限制,未能继续测通；根据已知序列进行基因组步移也未能得到更多序列。通过GenBank数据库比对以及运用生物信息学软件对EF568935进行了结构解析发现具有典型的I型PKS结构,如AT、KS、ACP等结构域,确定出各结构域及启动子的位置。 四、通过底物结合实验对新酰基转移酶AT-EF080951功能进行体外分析 AT结构域在PKS酶系中起选择加载起始和延伸单位的作用,其底物特异性(substrate specificity)是组合生物合成研究中的关注点。PKS部分基因簇EF568935中编码的酰基转移酶AT-EF080951通过生物信息学软件分析发现具有结合malonyl-CoA的特征。为确定其底物,本研究选择CoA、acetyl-CoA、malonyl-CoA和methylmalonyl-CoA共4种底物对AT-EF080951进行体外底物结合实验。 通过pMAL-c2x蛋白表达和纯化系统表达出MBP-AT-EF080951融合蛋白,并通过Xa因子酶切、分离出单独的AT-EF080951蛋白。用MBP、BSA蛋白以及空白作为对照,通过ELISA法做底物结合实验,然后通过公式计算4种蛋白对4种底物的结合常数,分析AT-EF080951的底物特异性。通过对比对照蛋白与底物的结合常数,可知AT-EF080951与4种底物的亲和力依次为Ka(acetyl-CoA)>Ka(malonyl-CoA)≈Ka(Methylmalonyl coenzyme As≈Ka(CoA),对后3种底物为非特异性吸附。底物结合实验结果表明MBP-AT-EF080951和AT-EF080951都特异性结合acetyl-CoA,Ka(acetyl-CoA)>Ka(malonyl-CoA),这与软件分析结果不符。 通过异源表达,产生可溶的、具有底物选择结合功能的MBP融合酰基转移酶MBP-AT-EF080951和单体酰基转移酶AT-EF080951,说明酰基转移酶在没有N端KS结构域、C端ACP结构域及细胞内其它因子存在的情况下仍然对底物具有选择结合的能力。 五、通过结构域替换实验对AT-EF080951功能进行体内分析 菌株S.avermitilis ATCC31271中的avermectin合成酶系的全基因簇的序列已测通,各结构域功能均已有研究。为了进一步确定AT-EF080951体外结合实验的结果,本研究用AT-EF080951替换掉avermectin合成酶系基因簇的aveA1基因中模块2编码的AT2(3)结构域(结合malonyl-CoA),通过HPLC检测其产物变化。 本部分制备了S. avermitilis原生质体,构建同源打靶载体,电转化入原生质体中；通过双交换重组,用AT-EF080951替换掉aveA1基因中模块2的AT2(3)结构域基因；通过PCR筛选克隆并通过DNA测序鉴定重组正确；正确的突变株用种子培养基培养,培养液经甲醇抽提后用HPLC分析；结果显示在突变株中仍然存在avermectin,但含量减少。 实验结果说明AT-EF080951在体内可以利用malonyl-CoA延伸聚酮链,结果支持软件分析结论。结合类似的研究结果,本研究结果支持起始AT结构域的底物特异性在体内可能受其它因子作用,通过体外底物结合实验鉴定其特异性底物可能产生不准确的结论。