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研究目的:本研究旨在探讨模拟肿瘤微环境缺氧条件下促进人胰腺癌细胞释放高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)的机制,并进一步研究其促进人胰腺癌细胞侵袭迁移的作用及其潜在的分子机制。从而为胰腺癌的分子靶向治疗提供新的实验基础和理论依据,为指导胰腺癌的临床治疗提供新的方向。研究方法:1.应用生物信息学方法分析HMGB1在胰腺癌中的临床意义。2.运用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测不同胰腺癌细胞(Bx PC3、As PC1、Pa Tu8988、SW1990、Panc1)中HMGB1的表达量。3.运用Western blot及酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测不同缺氧时间处理后人胰腺癌细胞Pa Tu8988上清中HMGB1的含量。4.运用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测人胰腺癌细胞Pa Tu8988中HMGB1经缺氧处理后发生核转位的过程。5.运用Western blot、透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)及IF检测缺氧条件下人胰腺癌细胞Pa Tu8988释放的HMGB1与外泌体的相关性。6.运用蔡司荧光显微镜、Western blot及实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(Quantitative-Real Time polymerase chain reaction,q PCR)检测在人胰腺癌细胞Pa Tu8988中干扰HMGB1的效率。7.运用Western blot检测人胰腺癌细胞Pa Tu8988与rh HMGB1以及缺氧上清(Sup-sh-EGFP、Sup-sh-HMGB1)共培养后上皮间充质转化相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Snail、MMP-9)的变化。8.运用Transwell侵袭迁移及划痕实验检测人胰腺癌细胞Pa Tu8988与rh HMGB1以及缺氧上清(Sup-sh-EGFP、Sup-sh-HMGB1)共培养后侵袭迁移能力的变化。9.运用Western blot检测人胰腺癌细胞Pa Tu8988与rh HMGB1以及缺氧上清(Sup-sh-EGFP、Sup-sh-HMGB1)共培养后脂质合成相关蛋白(Pro-SREBP1、M-SREBP1、FAS、SCD1、ACLY)的变化。10.运用蔡司荧光显微镜、Western blot及q PCR检测在人胰腺癌细胞Pa Tu8988中干扰SREBP1的效率。11.运用Western blot检测稳转细胞株人胰腺癌细胞Pa Tu8988-sh-SREBP1与rh HMGB1共培养后上皮间充质转化相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Snail、MMP-9)及脂质合成相关蛋白(Pro-SREBP1、M-SREBP1、ACC、FAS、ACLY)的变化。研究结果:1.数据库结果分析表明,与正常胰腺组织相比,HMGB1在胰腺癌组织中高表达,表达水平与生存率呈负相关,且HMGB1的表达与胰腺癌的分期没有相关性。2.Western blot检测结果表明HMGB1在人胰腺癌细胞Pa Tu8988中的表达量最高。3.Western blot及ELISA检测结果表明经过不同缺氧时间处理后,人胰腺癌细胞Pa Tu8988在缺氧处理48 h后上清中HMGB1的含量最多。4.IF检测结果显示了人胰腺癌细胞Pa Tu8988经缺氧处理后HMGB1发生核转位的过程。5.TEM检测结果表明细胞培养上清中具有微囊泡结构;Western blot检测到外泌体膜相关标志蛋白(CD9、CD63、CD81、HSP70)的表达和外泌体中HMGB1的表达;IF检测结果表明在缺氧条件下人胰腺癌细胞Pa Tu8988释放的HMGB1与外泌体膜标记蛋白CD63的共定位增多。6.蔡司荧光显微镜、Western blot及q PCR检测结果表明已经成功将HMGB1的干扰质粒sh-HMGB1转进人胰腺癌细胞Pa Tu8988,且具有较高的干扰效率。成功构建稳定干扰HMGB1的胰腺癌细胞株Pa Tu8988-sh-HMGB1。7.Western blot检测结果表明人胰腺癌细胞Pa Tu8988与PBS、rh HMGB1、Sup-sh-EGFP及Sup-sh-HMGB1共培养后,rh HMGB1及Sup-sh-EGFP培养组E-cadherin表达降低,N-cadherin、Snail、MMP-9表达增高。8.Transwell侵袭迁移实验和划痕实验检测结果表明人胰腺癌细胞Pa Tu8988与PBS、rh HMGB1、Sup-sh-EGFP及Sup-sh-HMGB1共培养后,rh HMGB1及Sup-sh-EGFP培养组侵袭迁移能力增强。9.Western blot检测结果表明人胰腺癌细胞Pa Tu8988与PBS、rh HMGB1、Sup-sh-EGFP及Sup-sh-HMGB1共培养后,rh HMGB1及Sup-sh-EGFP培养组Pro-SREBP1、M-SREBP1、FAS、SCD1、ACLY表达上调。10.蔡司荧光显微镜、Western blot及q PCR检测结果表明已经成功将SREBP1的干扰质粒sh-SREBP1转进人胰腺癌细胞Pa Tu8988,且具有较高的干扰效率。成功构建稳定干扰SREBP1的胰腺癌细胞株Pa Tu8988-sh-SREBP1。11.Western blot检测结果表明稳转细胞株人胰腺癌细胞Pa Tu8988-sh-SREBP1与rh HMGB1共培养后,与对照组相比E-cadherin表达上调,N-cadherin、Snail、MMP-9表达下调,Pro-SREBP1、M-SREBP1、FAS、ACLY、ACC表达下调。研究结论:1.缺氧可以促进人胰腺癌细胞释放HMGB1,且可以通过外泌体途径释放。2.HMGB1可以促进人胰腺癌细胞的侵袭迁移。3.HMGB1可通过促进人胰腺癌细胞的脂质合成从而提高人胰腺癌细胞侵袭迁移能力。