背景与目的淋巴瘤是目前发病率增长最快的恶性肿瘤之一,是严重危害人类健康的疾病。NK/T细胞淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤的一个亚型,发病率居T细胞淋巴瘤的首位,中国发病率远高于西方国家,WHO于2001年将其作为淋巴造血组织肿瘤中的一种独立类型。恶性淋巴瘤的病因和发病机制还不完全明确,一般认为是多种因素相互作用的结果,如病毒感染、某些理化刺激、免疫缺陷等。化疗、放疗、免疫治疗和生物治疗等是目前治疗淋巴瘤的主要手段,虽然部分亚型的淋巴瘤通过上述治疗能够在早期获得较好的治疗效果,但仍有部分类型淋巴瘤难以得到有效治疗,或者在治疗后出现复发。目前研究表明淋巴瘤的复发、耐药等生物学特性与某些关键靶标基因或小分子标志物有着重要联系,因此开展淋巴瘤的基础和临床研究,为临床诊治提供有效作用靶点和标志物,具有重要意义。近年来陆续发现一些miRNA与哺乳动物造血细胞的分化,造血过程以及血液系统疾病发生密切相关。最近研究表明,特定的miRNA在T细胞和B细胞发育过程中也起重要的调节功能。另外,miRNA与淋巴瘤的发生也有一定的相关性。例如在弥漫性大B淋巴瘤中发现miRNA-17-92家族可与癌基因C-myc相互协调,诱导淋巴瘤形成。miRNA-17-92家族也可以调控PTEN肿瘤抑制基因和Bim促凋亡蛋白来促进淋巴增生性疾病和自身免疫病的形成。近年来许多研究证实miRNA-155具有广泛多样的生物学功能：miRNA-155在造血细胞分化过程中扮演重要角色；miRNA-155在炎症因子调控以及免疫反应中发挥着重要的生物学作用；miRNA-155在不同肿瘤中高表达,与其他表达下调的miRNAs直接或间接作用,促使肿瘤发生发展。miRNA-155在淋巴瘤病人样本中的表达量是正常组织的10-30倍,而不同淋巴瘤细胞中miRNA-155的表达量也不尽相同,说明miRNA-155可能淋巴瘤的发生分化有一定的相关性。目前,围绕miRNA-155在胃癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病及B细胞淋巴瘤中作用机制的研究已有不少涉及,但在其他类型如T细胞和NK细胞淋巴瘤中,miRNA-155的表达情况和相关研究鲜有报道。本课题利用高通量测序技术对NK/T细胞淋巴瘤细胞株SNK-6和YTS以及正常NK细胞的小RNA进行了高通量深度测序,检测这些细胞系中基因和miRNA表达谱；筛选并建立内源性高表达和低表达miRNA-155的淋巴瘤细胞系,研究其生物学特性,并对高通量检测数据进行生物信息学分析。从而评价miRNA-155对淋巴瘤细胞生物学特性的影响,揭示miRNA-155在淋巴瘤细胞中的分子作用机制,为淋巴瘤的基础和临床研究提供新的诊治靶点,同时为miRNA在恶性肿瘤中的研究,提供新的有效研究方法。主要内容第一部分：NK/T细胞淋巴瘤细胞系小RNA测序及miRNA-155的表达鉴定方法：1.提取NK细胞、NK/T细胞淋巴瘤细胞系SNK-6细胞和YTS细胞总RNA,纯化总RNA,使提取的总RNA达到建库测序要求；利用华大基因solexa高通量测序技术对上述细胞系进行小RNA测序。2.测序结果的生物信息学分析：首先对小RNA测得的原始数据(Rawdata)进行基本数据评估和处理,然后进一步进行高级生物信息学分析,包括：基因组比对；已知miRNA鉴定和统计信息、表达谱信息；重复序列比对；Genbank和Rfam比对；外显子、内含子比对；小RNA分类注释；候选miRNA预测；miRNA差异分析；聚类分析；miRNA靶基因预测。3.为了进一步鉴定高通量测序的可靠性,我们又从中选取了miRNA-34a、 miRNA-34b、miRNA-34c、miRNA-155、miRNA-21、 miRNA-221在细胞株中重新利用Real Time PCR进行验证。结果：1. 通过solexa测序技术对NK/T细胞淋巴瘤细胞株SNK-6和YTS以及正常NK细胞的小RNA进行了高通量深度测序,分别获得7476202、6903218和8458056条clean reads,并且绝大多数序列集中在18-24nt左右。通过生物信息学比对分析,分别在正常NK细胞、SNK-6细胞和YTS细胞中确定194、221和276条已知miRNA,发现了42、72和161个新的miRNA。2.通过对SNK-6和YTS以及正常NK细胞中已知miRNA的差异比对、聚类分析和进一步生物学信息分析,在SNK-6中确定了25个表达上调和12个表达下调的候选microRNA;在YTS中确定了30个表达上调和12个表达下调的候选microRNA。3.通过Real Time PCR技术进一步鉴定了部分microRNA的表达情况,结果显示大部分microRNA表达情况与高通量测序得到的结果一致,但部分microRNA表达情况并不一致。同时发现miRNA-155在SNK-6细胞中的相对表达量显著高于NK细胞,提示miRNA-155可能在SNK-6细胞中发挥了重要作用。第二部分：microRNA-155在NK/T细胞淋巴瘤患者血清中的表达及临床意义方法：1.标本采集与预处理来自郑州大学第一附属医院肿瘤科2011年9月至2013年1月收治的淋巴瘤患者,其中NK/T细胞淋巴瘤患者20例,对照为健康人15例。取初治或每次化疗前外周静脉血,分离血清标本。所有患者均签署了知情同意书。所收集的患者资料项目包括姓名、性别、年龄、症状开始日期、确诊日期、开始治疗日期、首发部位、分期检查方法、有无B症状、骨髓情况、Ann Arbor分期、淋巴结累及数、结外累及部位数、PS评分、ALB、LDH、血清Hb、治疗前白细胞计数、治疗方案、近期治疗效果及远期生存情况等。临床、病理或预后资料不全的病例均被排除在本课题研究之外。所有的病理标本均经过国内三位有经验的病理科专家根据WHO分类标准进行重新阅片。健康对照者必须排除慢性感染或自身免疫病。2.采用上海Novland血液(血清/血浆)总RNA抽提试剂盒提取血清总RNA。3.通过Real Time PCR方法对淋巴瘤患者及正常对照外周血血清中的miRNA-155进行定量检测,分析其在淋巴瘤及正常人血清中表达情况。结果：1. miRNA-155在NK/T细胞淋巴瘤患者中的表达明显高于正常对照血清,提示miRNA-155可能与NK/T细胞淋巴瘤的发生发展有关。2.淋巴瘤血清中miRNA-155的表达量与分期、有无B症状、LDH和β2-MG水平无相关性；miRNA-155在化疗无效组(SD+PD)中的表达明显高于化疗有效组(CR+PR),提示miRNA-155可能作为疗效判定的潜在分子标志物。第三部分：miRNA-155对NK/T细胞淋巴瘤细胞系的生物学特性影响方法：1. Real Time PCR检测miRNA-155在淋巴瘤细胞系中的表达：提取各淋巴瘤细胞系(SNK-6、YTS、Jurket和DOHH2)的总RNA,逆转录miRNA-155和U6,荧光定量PCR采用TaKaRa荧光定量试剂盒进行定量分析。2.真核表达载体构建：将合成的miRNA-155及anti-miRNA-155 oligonucleotide片段退火,-20℃C保存。退火片断和ScaI及XhoI酶切pEGFP-C3连接构建miRNA-155及anti-miRNA-155真核载体。Bgl Ⅱ酶切鉴定转化克隆,并将鉴定正确的克隆进行测序。3.慢病毒载体的构建与包装：NheI和EcoRI酶切真核表达载体pEGFP-miRNA-155、pEGFP-anti-miRNA-155以及pLL3.7,构建慢病毒表达载体。抽提高纯度无内毒素慢病毒表达质粒及其辅助包装原件载体质粒,用脂质体2000共转染293T细胞,包装慢病毒Lenti(-)、Lenti-miRNA-155和Lenti-anti-miRNA-155。48h后收获慢病毒,浓缩纯化重组慢病毒,并根据绿色荧光蛋白表达情况利用倍比稀释法测定慢病毒滴度。4.重组慢病毒感染淋巴瘤细胞：用无血清培养基梯度稀释病毒液,以不同MOI的重组慢病毒感染SNK-6淋巴瘤细胞系。4天后观察荧光表达情况,计算100个细胞中的荧光细胞数量,评价淋巴瘤细胞株对慢病毒的感染效率。5.检测重组慢病毒感染SNK-6淋巴瘤细胞后的miRNA-155表达：重组慢病毒(Lenti(-)、Lenti-miRNA-155以及Lenti-anti-miRNA-155)以MOI=100感染淋巴瘤细胞SNK-6,48h后提取总RNA,反转录miRNA-155及U6,用Real Time PCR的方法检测各组miRNA-155的表达情况。6.CCK-8检测miRNA-155对淋巴细胞的生长增殖作用：以MOI=100的重组慢病毒稀释液感染SNK-6细胞,共分为四组：空白组(PBS)、阴性对照组(Lenti(-))、miRNA-155高表达组(Lenti-miRNA-155)、 miRNA-155干扰表达组(Lenti-anti-miRNA-155)。72h后,用CCK8检测SNK-6淋巴瘤细胞增殖活性。7. Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡：以MOI=100的重组慢病毒稀释液感染SNK-6细胞,共分为四组：空白组、阴性对照组(Lenti(-))、miRNA-155高表达组(Lenti-miRNA-155)及miRNA-155干扰表达组(Lenti-anti-miRNA-155)。48h后收集细胞,用Anne-xin V/PI双染试剂染色后进行流式细胞仪分析。8. miRNA-155对三氧化二砷(AS2O3)淋巴瘤细胞毒作用的影响：以MOI=100的重组慢病毒稀释液感染SNK-6细胞,共分为5组：空白组、As2O3处理组、阴性对照组(Lenti(-))、As2O3联合miRNA-155高表达组、As2O3联合miRNA-155干扰表达组。48h后收集样本,加入Annexin V/PI双染试剂染色,进行流式细胞仪分析。9.在淋巴瘤细胞系中miRNA-155对靶基因FOXO3a蛋白表达的影响：利用TargetScan在线软件预测,miRNA-155靶基因FOXO3a,用含有MOI=100的重组慢病毒稀释液感染SNK-6细胞,共分为四组：空白组(PBS)、阴性对照组(Lenti(-))、miRNA-155高表达(Lenti-miRNA-155、miRNA-155干扰表达组(Lenti-anti-miRNA-155)。48h后收集细胞总蛋白,WesternBlot检测靶基因FOXO3a的表达情况。结果：1.结果显示四种淋巴瘤细胞系YTS、SNK-6、Jurkat和DOHH2中miRNA-155的相对表达量分别为7.47±2.25、78.96±18.80、17.84±4.09和1(DOHH2设定为参比细胞),其中SNK-6细胞系中的表达明显高于其他细胞系(P<0.05),DOHH2细胞表达量较其他细胞相对表达量最低(P<0.05),Jurkat细胞相对表达量显著高于YTS和DOHH2细胞(P<0.05)。2.慢病毒表达载体构建中,真核表达载体BⅢ酶切鉴定结果表明,合成的miRNA-155和anti-miRNA-155片段插入pEGFP-C3真核表达载体中。测序结果经Lasergene软件中MegAlign比对分析表明：测序结果与设计合成的miRNA-155的序列以及anti-miRNA-155序列是一致的,说明真核表达载体克隆构建正确。XhoI酶切结果与理论一致,表明慢病毒载体构建成功。3.将慢病毒表达质粒Lenti(-)、Lenti-miRNA-155、Lenti-anti-miRNA-155及慢病毒包装质粒pCMV-dR8.2和pCMV-VSV-G共转染至293T细胞中,48h后,收集含有病毒的上清液,浓缩并纯化重组慢病毒,利用绿色荧光蛋白报告基因表达情况测得病毒滴度可达109IFU/ml以上,且三种重组慢病毒Lenti(-)、Lenti-miRNA-155和Lenti-anti-miRNA-155的滴度分别为：109.13±0.15、109.11±0.24和109.15±0.12IFU/ml,滴度之间无明显差别(P>0.05)。4.重组慢病毒的感染效率随MOI增加而逐渐升高,MOI<10的情况下,感染效率较低<10%；MOI=10时,感染效率可提高至达30%以上；MOI>10时,重组慢病毒对淋巴瘤的感染效率明显提高,达60%以上,MOI=100时三种重组慢病毒Lenti(-)、Lenti-miRNA-155和Lenti-anti-miRNA-155感染SNK-6效率分别为72.09±2.96%、72.36±2.39%和72.89±5.65%,三者之间无明显差异(P>0.05)。5. Real Time PCR检测重组慢病毒Lenti(-)、Lenti-miRNA-155和Lenti-anti-miRNA-155感染SNK-6细胞前后miRNA-155的表达情况表明,重组慢病毒Lenti(-)感染淋巴瘤细胞株前后miRNA-155的表达无明显差异(P>0.05)；重组慢病毒Lenti-miRNA-155感染后,miRNA-155的表达明显增强(P<0.05),其相对表达量为：4.33±1.245；而重组慢病毒Lenti-anti-miRNA-155感染后,miRNA-155的表达明显降低(P<0.05),其相对表达量为0.37±0.052。6.利用CCK8细胞活性检测法检测了重组慢病毒Lenti(-)、Lenti-miRNA-155和Lenti-anti-miRNA-155感染SNK-6后细胞增殖活性。结果显示Lenti(-)组、Lenti-miRNA-155组和Lenti-anti-miRNA-155组的SNK-6淋巴瘤细胞增殖活力分别为：0.7828±0.043、0.857±0.050和0.533±0.052,其中,Lenti-miRNA-155组与Lenti(-)组相比,增殖活性无明显差异(P>0.05),但Lenti-anti-miRNA-155较其他两组相比,细胞增殖活性明显下降(P<0.05)。7. Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡。利用Annexin V/PI双染法检测重组慢病毒感染SNK-6淋巴瘤细胞系后,细胞凋亡情况。凋亡细胞比例分别为：(11.2±1.24)%、(12.3±1.67)%和(63.2±5.78)%。结果表明,Lenti-anti-miRNA-155感染SNK-6淋巴瘤细胞后,细胞凋亡明显增加。8.流式细胞仪结果分析：空白组、三氧化二砷组、阴性对照组、三氧化二砷联合miRNA-155高表达组、三氧化二砷联合miRNA-155低表达组作用后的SNK-6凋亡细胞比例分别为(1.5±0.236)%、(4.7±3.101)%、(11.7±3.027)%,(11.2±3.1)%和(61.2±4.561)%。三氧化二砷联合miRNA-155低表达组对淋巴瘤细胞的生长抑制和杀伤作用更为明显,病理形态改变更为显著。其中三氧化二砷联合miRNA-155低表达组凋亡细胞比例较其他各组最高,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；三氧化二砷组、阴性对照组和三氧化二砷联合miRNA-155高表达组间细胞凋亡率无明显差异(P>0.05)。9.通过Targetscan在线miRNA预测软件预测FOXO3a为miRNA-155靶基因,通过Western Blot检测FOXO3a蛋白表达,发现miRNA-155高表达组FOXO3a表达量低于阴性对照组,而miRNA-155抑制表达组FOXO3a蛋白表达较高。通过灰度分析了miRNA-155抑制组与其他两组之间有显著性差异(P<0.05),高表达组与阴性对照组之间没有显著性差异(P>0.05)。结论1.通过solexa高通量测序技术,对NK细胞、SNK-6细胞和YTS细胞进行了小RNA高通量测序,通过生物学信息分析,在SNK-6和YTS中确定了一些表达上调和表达下调的候选microRNA。miRNA-155在SNK-6细胞中的相对表达量显著高于NK细胞,提示miRNA-155可能在SNK-6细胞中发挥了重要作用。2. MiRNA-155在NK/T细胞淋巴瘤患者血清中的高表达,提示miRNA-155可能与NK/T细胞淋巴瘤的发生发展有关,同时也可能是疗效判定的潜在分子标志物。3.通过对miRNA-155在NK/T细胞淋巴瘤细胞株SNK-6细胞的生物学功能研究,发现miRNA-155与SNK-6细胞的生长增殖、凋亡、细胞周期、药物敏感性有密切关系,同时还发现miRNA-155可能通过FOXO3a作用通路影响NK/T淋巴瘤生物学功能。