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目的SHP2（SH2-domain-containing protein tyrosine phoshpatase-2）是一种含有Src同源结构域的非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶,最早在Moynahan综合征中被发现。SHP2在肿瘤的进展中以组织类型依赖性的方式发挥双重效果。几项研究已将SHP2与癌症的侵袭行为和癌症病人的恶化结局联系起来。尽管如此,关于SHP2如何促进乳腺癌进展的机制细节仍未明确。在此项研究里,我们首先利用免疫组织化学技术和SPSS软件探究了病理组织中SHP2与相关参数的关系。随后,我们使用CRISPR/Cas9构造了两种稳定敲除SHP2的乳腺癌细胞株,通过相关的体外及体内实验,阐明了SHP2通过调控Cyclin D1的稳定性进而影响乳腺癌细胞增殖的分子机制,为针对于乳腺癌的防治做指导。方法1.在101例乳腺癌患者中,通过免疫组化分析了SHP2的染色及定位情况,并利用SPSS探究其与病理学参数之间的关系。2.在MDA-MB-231和T47D中利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,使用两种不同的Guide RNA构建稳定敲除SHP2的单克隆细胞株,分析靶基因组DNA的核苷酸序列,并利用Western blotting实验进行敲除验证。3.通过平板克隆及CCK8实验对比SHP2稳定敲除细胞株和对照组细胞株间生长速度的快慢情况。4.在上述细胞系中,通过流式细胞术分析SHP2敲除对于细胞周期进展的影响,并通过Ed U实验分析分裂期细胞比例。5.分别采用RT-PCR和Western blotting实验明确敲除SHP2对于细胞周期蛋白Cyclin B1,Cyclin D1及Cyclin E1在m RNA及蛋白水平上的影响。6.在加入CHX及MG132后,通过Western blotting实验明确敲除SHP2对于Cyclin D1半衰期的影响并探究其降解机制。7.通过免疫荧光实验对比在不加及加入蛋白酶体抑制剂MG132后对照及敲除SHP2细胞系中Cyclin D1的定位变化。8.通过泛素化实验明确SHP2对于Cyclin D1稳定性的调节。9.通过Western blotting实验验证SHP2敲除诱导的Cyclin D1降解是否与T286磷酸化有关,并利用免疫荧光技术观察P-Cyclin D1T286定位及荧光强度。10.通过Western blotting实验研究在对照组及SHP2基因敲除细胞中Ser9磷酸化的GSK3β的表达水平。11.在加入GSK3β抑制剂CHIR99021后,通过Western blotting实验探究其对SHP2敲除诱导的Cyclin D1蛋白水解的影响,并利用免疫荧光技术明确Cyclin D1的定位。12.通过Western blotting实验探究SHP2敲除对于PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路的影响,以确定在我们的细胞模型里哪个分子激活了GSK3β。13.构建SHP2rescue质粒,经病毒包装后感染SHP2稳定敲除的MDA-MB-231细胞,通过Western blotting实验验证拯救效果,通过CCK8和克隆形成实验观察增殖能力变化,通过流式细胞术和Ed U实验分析细胞周期及分裂期细胞占比,通过免疫荧光技术分析定位。14.构建裸鼠增殖模型,将MDA/control,Ko SHP2,PCDH,SHP2rescue四组细胞通过皮下注射到小鼠体内,分析不同组肿瘤重量及体积的变化,并通过免疫组织化学染色分析SHP2,Cyclin D1及KI67的表达情况。结果1.在病理组织中,SHP2主要定位于细胞质,SHP2与雌激素受体呈正相关（P=0.026）,SHP2的高表达与淋巴结转移相关（P=0.039）。此外SHP2表达与肿瘤大小（P=0.003）和KI67水平（P=0.005）密切相关。2.在MDA-MB-231及T47D里把SHP2敲除。3.SHP2表达缺失后,细胞的生长速度显著减慢。4.SHP2的敲除延迟了细胞周期中G1到S的相变。5.在敲除SHP2后,与对照组细胞相比,Cyclin B1,Cyclin E1在m RNA及蛋白水平均没有发生明显变化,而Cyclin D1的表达明显降低。6.在加入放线菌酮后,SHP2敲除细胞株中Cyclin D1的半衰期显著缩短,而在加入MG132后,Cyclin D1在2h后能够恢复到内源性水平。7.在存在或不存在MG132的情况下,Cyclin D1主要位于对照细胞的细胞核里。相反,MG132处理后,SHP2基因敲除细胞中Cyclin D1的增加主要位于细胞质中。8.SHP2的缺失使乳腺癌细胞中泛素化的Cyclin D1增高,确定SHP2敲除后Cyclin D1是通过泛素蛋白酶体途径快速降解的。9.SHP2的敲除使细胞中p-Cyclin D1T286的表达增高。p-Cyclin D1（T286）在对照大部分位于细胞核,SHP2敲除后大部分位于细胞质。10.SHP2缺失后,p-GSK3β（Ser9）表达水平显著降低。11.GSK3β抑制剂CHIR99021拯救了由SHP2敲除诱导的Cyclin D1蛋白的表达,此外CHIR99021处理导致Cyclin D1的核表达显著增加。12.SHP2的敲除使p-AKT（T308）表达降低,从而介导了GSK3β的激活。13.成功构建SHP2rescue细胞系,与敲除组细胞相比,SHP2rescue组细胞的增殖能力明显恢复,核定位表达增加。14.SHP2敲除组细胞肿瘤的生长速度明显比对照组细胞慢,SHP2rescue细胞的肿瘤的生长速度与对照组细胞的生长速度相似。SHP2敲除导致肿瘤的重量明显降低。此外,SHP2缺失后,KI67和Cyclin D1的IHC染色表达显著下调。结论我们的研究表明SHP2在乳腺癌中起着致癌作用。SHP2是经由调节Cyclin D1的稳定能力并促进细胞生长来实现增殖的。SHP2敲除使PI3K/AKT通路传递受阻,并引起GSK3β的激活。激活后的GSK3β使p-Cyclin D1T286增高,并促进Cyclin D1的核输出,从而促进其经由泛素蛋白酶体快速降解。总体而言,我们的研究揭示了SHP2调节乳腺癌增殖的机制,提示SHP2可能作为乳腺癌的潜在治疗靶标。