人类精子、体外成熟卵细胞及植入前胚胎印记基因H19、PEG1、KvDMR1的DNA甲基化状态研究

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人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology, ART)在我国开展已有20余年,卵细胞体外成熟、胚胎冷冻等配套技术也在临床上成熟应用,通过辅助生殖技术出生的后代正逐渐成为人口的一个重要组成部分,因此ART技术的安全性成为人们关注的焦点。已有较多的相关研究,但得出的结论不尽一致。近年来有较多的研究认为常规体外受精(IVF)和卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)可能会增加Angelman综合征(AS)、Beckwith-Wiedemann综合征(BWS)的发病风险,且经ART技术出生的BWS、AS患儿出现基因印记缺陷的比例显著高于自然妊娠。因此ART技术与基因印记缺陷的关系成为目前研究的热点。动物实验证实控制性超排卵、卵细胞体外成熟、胚胎体外培养、显微注射等ART操作可导致卵细胞、胚胎出现DNA甲基化改变,从而使子代发生印记缺陷疾病。然而动物实验的结果不能完全代替人体研究。有关人卵细胞和胚胎甲基化研究报道较少,主要原因在于受伦理、法律等因素的制约。本研究收集了ART患者的精子细胞、体外成熟的卵细胞、新鲜及冷冻后的植入前胚胎,分析H19、PEG1、KvDMR1三个具有代表性的印记基因的甲基化状态,初步探索ART技术相关的表观遗传学风险,希望有助于全面评价ART技术的安全性。第一章ART患者精子细胞及受精后胚胎印记基因H19、PEG1、KvDMR1的DNA甲基化状态研究[研究目的]既往研究发现少精子症患者可出现精子细胞印记基因甲基化异常,且异常的印记能传递到子代绒毛。本研究选择ART治疗中废弃或剩余的精子和胚胎为研究对象,分析印记基因H19、PEG1、KvDMR1的DNA甲基化状态,了解ART治疗过程中与精子相关的表观遗传学风险,以及异常甲基化印记能否传递到胚胎,有助于初步的评估ART技术的安全性。[研究方法]经医院伦理委员会批准及患者知情同意,选择2008年一2011年在广州南方医院及贵阳市妇幼保健院行IVF/ICSI治疗的患者,授精完成并观察到卵子正常受精后,收集剩余的精子样品。胚胎移植术后收集患者废弃的Day3胚胎。(1)共收集到精子样品130份,根据术前精子参数分为4组,其中:(A)正常精子参数组(Normospermia):50份。精子密度>20×106/mL,;(B)轻度少精子症组(Moderate oligospermia):40份。5×106/mL<精子密度<20×106/mL;(C)严重少、弱精子症组(Severe oligospermia):25份。精子密度<5×106/mL;(D)附睾/睾丸精子(梗阻性无精子症)组:15份。采用结合重亚硫酸盐的限制性酶分析(Combined Bisulfite Restriction Analysis, COBRA)和亚硫酸盐测序PCR (Bisulfite Sequencing PCR, BSP)技术检测精子细胞印记基因H19、PEG1、KvDMR1的DNA甲基化状态;(2)根据检测结果,选择精子甲基化异常的病例,分析Day3胚胎甲基化状态,另选精液参数正常病例的胚胎作为对照,所研究的基因种类与精子甲基化异常的印记基因对应。60个胚胎用于H19检测、83个胚胎用于PEG1检测、58个胚胎用于KvDMRl检测。[研究结果](1)130份精子样品共检测到18份甲基化异常,总体异常率13.8%。轻度少精子组的甲基化异常率为20.0%(8/40);重度少精子症组的甲基化异常率为32.0%(8/25);附睾/睾丸精子组甲基化异常率12.3%(1/15);正常密度参数的精子亦可出现甲基化异常,异常率为2.0%(1/50)。比较正常参数精子和异常参数精子(包括轻度、重度少精子症及附睾/睾丸精子)的甲基化异常率:异常参数精子有较高的印记基因DNA甲基化异常率(21.3%),显著高于正常参数精子(2.0%)(χ2=9.56,P=0.002);(2)比较不同基因的异常甲基化发生率:PEG1基因共检测到12份样品甲基化异常,PEG1异常率9.2%(12/130)显著高于H19异常率(2.3%)及KvDMRl异常率(2.3%)(χ2=5.73,P=0.017)。;(3)单个胚胎PCR扩增结果:45个胚胎H19基因扩增成功,成功率75.0%;56个胚胎PEG1扩增成功,成功率67.5%;40个胚胎KvDMRl扩增成功,成功率69.0%;201个空白PCR反应结果均为阴性(4)胚胎印记基因甲基化状态检测结果:a.H19:平均甲基化程度为49.7%±9.3%。发现5个胚胎为异常的低甲基化模式,总异常率12.5%(5/40),其中4个胚胎属于H19甲基化异常精子组(异常率30.8%,4/13),1个胚胎属于精子参数正常的IVF对照组(异常率3.1%,1/32),2组异常率有显著差异(χ2=4.62,P=0.031);b.PEG1:平均甲基化程度为51.1%±7.6%。发现8个胚胎为异常高甲基化模式(甲基化%=100%),均属于PEGl异常高甲基化精子组(异常率25.8%,8/31)。精子参数正常的IVF对照组25个胚胎中出现2个异常的低甲基化胚胎(印记缺失,甲基化%=0%),而未出现异常的高甲基化(异常高甲基化发生率为0%),PEGl印记异常精子组的胚胎异常高甲基化发生率高于正常参数精子组(χ2=5.57,P=0.018);c.KvDMRl:平均甲基化程度为47.9%±8.7%。甲基化异常精子组的胚胎未出现甲基化异常,正常参数精子组出现3个胚胎异常的低甲基化状态。[研究结论](1)少精子症、无精子症的不育男性,其精子DNA发生印记基因甲基化异常的比例高于正常精液参数的患者;异常的甲基化状态可能是异常的生精过程中伴有甲基化转移酶(Dnmts)等因子的活性改变所致,需要进一步的研究。正常精子密度的精子细胞亦可发生甲基化异常,但异常率较低;(2)携带异常印记的精子有可能通过ICSI技术传递到胚胎。IVF产生的胚胎未出现相对应的印记异常,可能与印记异常的精子自然受精能力低下有关,故使用IVF可能风险较小;(3)ICSI出生子代出现印记缺陷的绝对发病率很低,但仍有必要严格掌握ICSI应用指征,最大限度的降低表观遗传学风险;对少弱精症及无精子症的不育患者应该告知其子代发生印记基因异常的风险可能增加(4)进一步的工作需要扩大样本量、扩展研究的基因种类,以证实上述的初步假设。第二章卵母细胞体外成熟、胚胎低温冷冻对人早期胚胎印记基因DNA甲基化状态的影响第一节体外成熟卵细胞受精后胚胎印记基因H19、PEG1的DNA甲基化状态[研究目的]卵母细胞体外成熟(in vitro maturation, IVM)技术是一项新的ART衍生技术,操作简便,能有效减少卵巢过度刺激综合征的发生、降低治疗费用,特别适合于PCOS/PCO的患者,已有较多的婴儿通过该技术出生。近年来有研究提示IVM可导致卵细胞出现印记基因甲基化异常,本研究收集IVM患者体外成熟的卵细胞及受精后的早期胚胎,检测其印记基因H19、PEG1的DNA甲基化状态,为评价IVM技术的表观遗传学安全性提供初步的依据。[研究方法](1)研究对象:经医院伦理委员会批准及患者知情同意,选择2009—2011年在贵阳市妇幼保健院54名行IVM治疗的PCOS/PCO患者,收集体外培养48小时后成熟障碍的GV期(Germinal vesicle)和MⅠ期(MetaphaseⅠ)卵细胞93个,其中20名患者;胚胎移植或冷冻后收集废弃的正常受精(2PN)Day3胚胎115个,胚胎质量为2-9细胞,Ⅰ~Ⅳ级;授精完成并观察到卵子正常受精后,收集剩余的精子样品;研究对照选择常规促排卵行IVF/ICSI的患者,在胚胎移植术后收集剩余的正常受精(2PN)低质量Day3胚胎进行,胚胎质量为2-12细胞,Ⅰ~Ⅳ级。54名患者中,28例患者(65个胚胎和20名患者的43个卵细胞)用于H19分析,26例患者(50个胚胎和23例患者的50个卵细胞)用于PEG1分析(2)甲基化检测:采用结合重亚硫酸盐的限制性酶分析(Combined Bisulfite Restriction Analysis, COBRA)、焦磷酸测序(pyrosequencing)和亚硫酸盐测序PCR (Bisulfite Sequencing PCR, BSP)技术检测胚胎、卵细胞、精子细胞印记基因H19、PEG1的DNA甲基化状态,(3)采用SPSS13.0统计软件(Statistical Package for the Social Sciences),计量资料以均数±标准差表示,2样本均数比较采用t检验,2样本率的比较使用卡方检验(Chi-square Test)。[研究结果](1)单个胚胎bisulfite-PCR扩增结果:a.H19基因:IVM组52个扩增成功,成功率为80.0%(52/65);常规IVF/ICSI组58个扩增成功,成功率为82.9%(58/70);b.PEGl基因:IVM组37个扩增成功,成功率为74.0%(37/50);常规IVF/ICSI组40个扩增成功,成功率为69.0%(40/58);243个空白PCR反应结果均为阴性(2)单个胚胎印记基因DNA甲基化的COBRA分析结果:a.H19基因:IVM组胚胎的平均甲基化程度:48.1%±5.8%,常规IVF/ICSI组胚胎的平均甲基化程度:46.7%±6.0%,2组胚胎的H19甲基化程度无显著差别(t=1.98,P=0.258)。IVM组发现5个胚胎呈甲基化异常,异常率:9.6%(5/52),其中1个胚胎为低甲基化异常,4个胚胎为高甲基化异常;常规IVF/ICSI组2个胚胎出现低甲基化异常,异常率3.4%(2/58)。2组胚胎之间异常甲基化的发生率无显著差别(χ2=0.87,P=0.351);b.PEG1基因:IVM组胚胎的平均甲基化程度:51.9%±4.3%,常规IVF/ICSI组胚胎的平均甲基化程度:50.8%±5.7%,2组胚胎的PEG1甲基化程度无显著差别(t=1.99,P=0.411)。IVM组发现5个胚胎呈异常低甲基化,异常率:13.6%(5/37),常规IVF/ICSI组3个胚胎出现低甲基化异常,异常率7.5%(3/40),2组胚胎之间异常甲基化的发生率无显著差别(χ2=0.24,P=0.623)(3)IVM卵细胞的印记基因甲基化分析结果:胚胎H19的异常高甲基化状态及PEG1的异常低甲基化状态可能由于卵细胞的甲基化异常导致,故检测IVM组的卵细胞甲基化状态。a.H19基因:13例患者扩增成功,成功率65%(13/20)。5例(38.5%,5/13)出现H19基因的高甲基化异常,其中2例的对应胚胎出现H19高甲基化异常;b.PEG1基因:16例患者扩增成功,成功率69.6%(16/20);其中1例(6.3%,1/16)出现PEG1基因的低甲基化异常,但对应的胚胎PEG1为正常甲基化状态。(4)精子细胞H19甲基化分析结果:IVM组1例患者,常规IVF/ICSI组2例患者的胚胎出现异常的低甲基化模式,精子甲基化异常可能原因之一故检测这3个病例的精子样品H19甲基化状态,COBRA结果显示:3个病例的精子细胞H19基因为正常的高甲基化模式。[研究结论](1)IVM和常规IVF/ICSI胚胎H19、PEG1的异常甲基化发生率无显著差别,基因的甲基化程度亦无显著差别。胚胎的H19高甲基化异常可能是由于IVM卵细胞异常H19印记“传递”所致;胚胎PEG1异常低甲基化状态可能主要由于体外培养环境导致;(2)体外培养中停滞发育的MⅠ卵细胞可出现H19、PEGl异常甲基化状态,体外培养环境可能是印记异常的原因之一;(3)使用延迟成熟的MⅡ或不成熟的MⅠ卵细胞进行IVF或ICSI,可能会增加胚胎或子代发生基因印记缺陷的风险,因此应谨慎此类操作。第二节低温冷冻胚胎印记基因H19的DNA甲基化状态研究[研究目的]胚胎的冷冻保存技术(embryo cryopreservation)在人类辅助生殖技术中占有十分重要的地位,胚胎冷冻的临床妊娠率可以达到30%—50%,在我国已有大量的婴儿通过该技术出生。有关冷冻技术安全性的研究目前未形成一致的结论。低温冷冻和解冻的操作理论上可能干扰基因印记的正常建立和维持,但相关研究较少。本研究收集常规慢速冷冻及玻璃化冷冻后的Day3人胚胎,检测印记基因H19的DNA甲基化状态,并与新鲜未冷冻胚胎相比较,初步了解冷冻技术对胚胎基因印记的影响。[研究方法](1)经医院伦理委员会批准及患者知情同意,选择2008—2011年在广州南方医院和贵阳市妇幼保健院行IVF/ICSI治疗的患者,胚胎移植术后收集正常受精(two pronuclei,2PN)的低质量的Day3胚胎进行常规慢速冷冻或玻璃化冷冻保存,解冻后用于印记基因甲基化分析,其中常规慢速冷冻组78个,玻璃化冷冻组74个;本文第二章第一节中常规IVF/ICSI的70个Day3胚胎作为研究对照;(2)采用结合重亚硫酸盐的限制性酶分析(Combined Bisulfite Restriction Analysis, COBRA)、亚硫酸盐测序PCR (Bisulfite Sequencing PCR, BSP)技术检测印记基因H19的DNA甲基化状态,并与新鲜未冷冻胚胎相比较。(3)统计分析:采用SPSS13.0统计软件(Statistical Package for the Social Sciences),计量资料以均数±标准差表示,多个样本均数比较采用方差分析,样本率的比较使用卡方检验(Chi-square Test)[研究结果](1)单个胚胎bisulfite-PCR扩增结果:a.慢速冷冻组:40个胚胎PCR扩增成功,成功率为51.3%(40/78);b.玻璃化冷冻组:53个胚胎PCR扩增成功,成功率为71.6%(53/74);c.新鲜未冷冻组:58个胚胎PCR扩增成功,成功率为82.9%(58/70)。222个空白PCR反应结果均为阴性。3种类型的胚胎PCR成功率显著不同(χ2=17.58,P=0.000),慢速冷冻胚胎的PCR成功率较低(51.3%);(2)单个胚胎H19基因DNA甲基化的COBRA分析结果:a.慢速冷冻组:H19基因的平均甲基化程度为44.8%±6.4%,4个胚胎出现异常低甲基化,异常率10.0%(4/40);b.玻璃化冷冻组:H19基因的平均甲基化程度为47.5%±5.6%,7个胚胎出现异常低甲基化,异常率13.2%(7/53);c.新鲜未冷冻组:H19基因的平均甲基化程度为46.7%±6.0%,2个胚胎出现低甲基化异常,异常率3.4%(2/58);(3)甲基化程度比较:慢速冷冻、玻璃化冷冻和新鲜未冷冻胚胎H19基因的甲基化程度无显著差别(F=2.09,P=0.127);(4)异常甲基化发生率比较:慢速冷冻、玻璃化冷冻和新鲜未冷冻胚胎H19基因异常甲基化发生率无显著差别(χ2=3.48,P=0.175)[研究结论](1)慢速冷冻胚胎的bisulfite-PCR成功率低,可能由于慢速冷冻产生的冰晶对细胞造成机械性损害;(2)冷冻操作可能未增加胚胎甲基化异常的发生率;(3)进一步的工作是扩大样本量,扩展基因种类深入研究。
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