玉屏风散出自元代《丹溪心法》,全方以黄芪为君药,防风、白术为臣药,相辅相成。该方临床上广泛用于治疗哮喘、过敏性鼻炎、荨麻疹等过敏性疾病,主要在于减少疾病的复发,其作用机制的研究多数集中在调节Th1和Th2的平衡。但对于其如何防治过敏性疾病复发的具体作用机制尚不清楚。此外,关于玉屏风散防治变态反应复发的效应成分的研究还比较匮乏,大多数研究都集中在其中的多糖成分对于免疫调节的作用,而其他成分的研究相对较少。所以玉屏风散的物质基础研究及其防治变态性反应疾病复发的作用机制都是值得探索的问题。本文首先建立了玉屏风散的HPLC-MS指纹图谱,为进一步筛选效应成分提供物质基础。越来越多的研究表明上皮细胞(Epthelial Cell,EC)在激发和调节局部免疫反应中起关键作用,上皮细胞产生的一些关键细胞因子在过敏性疾病中起启动作用。所以我们建立了人支气管上皮细胞萃取法,筛选玉屏风散提取物中能与人支气管上皮细胞结合的成分。中药大多给药后被吸收入血,然后发挥相应的药效。所以又进一步分析细胞筛选到的成分是否能在玉屏风散的含药血清中被检测到,考察这些成分是否能够入血。最后通过体外与体内的药效学实验探索玉屏风散中可能的调控上皮细胞关键促过敏因子成分。研究思路与方法:一、玉屏风散HPLC-MS指纹图谱的建立建立玉屏风散HPLC-MS的指纹图谱及其部分成分的鉴定,为人支气管上皮细胞萃取提供相应的的分析条件和背景对照资料。本文采用Chrom-matrixGP-C18 ODS柱,以乙腈-0.05%甲酸水溶液为流动相体系,液相的检测波长为200-400 nm,流速为1mL/min,分析时间总共为100 min。质谱为电喷雾正离子模式电离,干燥气流速:240 L/hr;毛细管电压:2800 V;锥孔电压:40 V;干燥气温度:310℃;离子源温度:120℃;扫描范围为200-1000 m/z。对玉屏风散指纹图谱进行分析,共得到32个可能的成分峰,色谱峰的分离度较好、峰形对称。其中8个成分经过标准品的对照,鉴定为毛蕊异黄酮苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素、亥矛酚苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷。二、支气管上皮细胞萃取成分的分析及鉴定上皮细胞证实在过敏性疾病中起着关键调控作用,所以我们以玉屏风散指纹图谱为物质基础条件,建立了人支气管上皮细胞(16HBE)萃取结合液质联用的方法,然后用此方法筛选玉屏风散提取物中调控上皮细胞关键促过敏因子的效应成分。细胞萃取样品组的解离液中发现有五个成分(Ⅰ到Ⅴ)与人支气管上皮细胞结合,与玉屏风散提取物的指纹图谱上的色谱峰进行保留时间的对照,这五个结合成分Ⅰ到Ⅴ分别对应玉屏风散提取物指纹图谱中的13、18、20、21、25号峰。经MS鉴定,Ⅰ号峰的[M+H]+为447,离子峰碎片为m//z 447-→285;Ⅱ号峰Ⅰ号峰的[M+H]+为431,离子峰碎片为m/z431-→269;Ⅲ号峰的[M+H]+为285;Ⅳ号峰的[M+H]+为439,离子峰碎片为m/z 439-→277;V号峰的[M+H]+为285。由此判断这五个化合物分别为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、亥茅酚苷、芒柄花素。三、玉屏风散上皮细胞萃取成分的体外效应分析细胞萃取法结果显示毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、亥茅酚苷能与上皮细胞结合,可能为调节上皮细胞促过敏因子的活性成分。迅速增多的研究表明上皮细胞(EC)来源的TSLP在变态反应性疾病中起关键作用,所以通过体外观察这些单体成分对TSLP产生的影响,来进一步确定可能的活性成分。1.玉屏风散上皮细胞萃取成分对TNF-α诱导的人支气管上皮细胞分泌TSLP的影响:本实验室前期研究确立了以12.5 μg/ml的TNF-α溶液刺激16HBE 12 h后,可使16HBE产生大量的TSLP。本研究采用上述体外产生TSLP的模型,观察玉屏风散中与16HBE结合成分对TSLP的影响。结果表明毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷均能不同程度的抑制细胞TSLP的分泌,而未观察到亥茅酚苷对TSLP有明显作用。2.玉屏风散中与人支气管上皮细胞结合成分对人支气管上皮细胞增殖的影响:16HBE种于96孔板贴壁后,加入MTT孵育4h,然后加入三联液过夜,570 nm下测定OD值。结果表明,芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷对16HBE增殖没有影响,表明上述成分没有细胞毒作用,对TSLP具有调节作用。四、玉屏风散含药血清成分的测定细胞萃取结果发现有5个成分能与人支气管上皮细胞发生结合,如果这5个成分是可能的活性成分,那么是否也能在含药血清中被检测到呢?为了进一步筛选可能的效应成分,又进行了玉屏风散小鼠含药血清的测定。玉屏风散小鼠含药血清成分的测定:ICR小鼠灌胃给予玉屏风散,连续给药三天,每天两次,最后一次给药1 h后取血,HPLC-MS测定含药血清中的成分,分析条件同细胞萃取。样品组血清中发现3个成分峰a、b、c,经过LC-MS的鉴定这三个化合物分别为升麻素、毛蕊异黄酮、芒柄花素。五、玉屏风散上皮细胞萃取成分对Th2型过敏性炎症模型的影响体外活性实验结果发现毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷对TSLP的产生有不同程度的作用,而药物口服后大多分解为苷元入血发挥药效,且玉屏风散含药血清分析发现芒柄花素和毛蕊异黄酮。所以体内整体模型的药效研究,我们选择了两个以苷元形式存在的芒柄花素和毛蕊异黄酮为研究对象。1.本研究采用实验室前期建立的Th2型过敏性炎症致敏初期TSLP产生模型(TSLP产生模型),观察芒柄花素、毛蕊异黄酮对体内TSLP、IL-33、IL-25产生的影响。小鼠先预给药两天,然后开始造模,第1,2天用0.6%的FITC溶液攻击小鼠耳部皮肤致使其耳组织产生大量的TSLP、IL-33和IL-25,造模期间继续给药,小鼠连续给药5天。结果显示毛蕊异黄酮和芒柄花素三个剂量均能显著抑制耳组织中TSLP的产生,芒柄花素(10 mg/kg)和毛蕊异黄酮(5mg/kg)对IL-33的产生有明显的抑制作用,而毛蕊异黄酮(0.5 mg/kg)则能显著抑制IL-25的产生。2.观察单体成分诱导初期给药对Th2型过敏性炎症模型效应的影响。造模前预给药2天,第1,2天用1.5%的FITC涂于小鼠肚子进行造模,第1,2,3天继续给药,共给药5天。第6天用0.6%FITC涂于小鼠右耳,左耳涂等体积的溶剂对照。攻击24 h后取材,测定耳肿胀度及相关细胞因子。芒柄花素、毛蕊异黄酮均能抑制变应性接触性皮炎小鼠模型的耳肿胀度,降低耳重差。病理报告显示,芒柄花素和毛蕊异黄酮均能减轻耳组织的充血和水肿,减少炎性细胞的浸润。同时还能够抑制相关Th2型细胞因子的产生。3.玉屏风散中与人支气管上皮细胞结合成分对TNF-α诱导的人支气管上皮细胞NF-κB启动子活性的影响:建立NF-κB荧光素酶报告基因,观察药物对NF-κB启动子活性的影响。培养16HBE,种于24孔板中,转入构建的pNFκB-TA-luc质粒和Rellina Luciferase质粒组成双荧光素酶报告系统。质粒转染24 h加入药物,采用荧光素酶报告基因检测试剂盒进行荧光强度的检测。结果显示,毛蕊异黄酮、芒柄花素均能显著降低NF-κB启动子活性,提示毛蕊异黄酮和芒柄花素能抑制NF-κB的活化。4.玉屏风散中与人支气管上皮细胞结合成分对TNF-α诱导的人支气管上皮细胞NF-κB核转位的影响:16HBE种板爬片,饥饿处理过夜后加入药物预处理2 h后,用TNF-α刺激1 h,然用免疫荧光法观察药物对NF-κB核转位的影响。16HBE经TNF-α刺激后,NF-κB集中表达在核内,而空白组在胞浆中。结果发现,芒柄花素、毛蕊异黄酮能显著抑制NF-κB在核内的表达,抑制了 NF-κB的核转移,对NF-κB的激活有抑制作用。