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肿瘤的发生与发展对人类和宠物的健康构成巨大威胁。经改造后的溶瘤病毒可利用其自身特异性靶向肿瘤细胞的特点,在肿瘤细胞中大量复制,裂解后的肿瘤细胞和复制的病毒被机体免疫系统识别激活免疫反应,从而破坏肿瘤微环境,达到清除剩余的肿瘤细胞的目的。溶瘤病毒疗法联合放疗、化疗等治疗方法能进一步提高肿瘤的治疗效果。溶瘤病毒在人类肿瘤的临床治疗已有一定的运用,但利用溶瘤病毒治疗宠物肿瘤研究仍方兴未艾,改造病毒用于肿瘤检测也鲜有报道。本课题旨在利用CRISPR/Cas9和Cre/Lox基因编辑系统同时敲除伪狂犬病毒(PRV)和Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)的多个毒力和复制相关基因,分别用于肿瘤的治疗及检测。与传统的单个基因逐步敲除的基因重组缺失技术相比,基于CRISPR/Cas9和Cre/Lox基因编辑系统既减少工作量又缩短纯化时间,更加高效、便捷。本论文一共分为两部分,第一部分为PRV病毒TK和gE基因双敲除,用于肿瘤的治疗。其主要结果概括如下:1.利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除gE和TK两个基因,并分别插入绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(mCherry)。联合使用低熔点琼脂糖噬斑、梯度稀释及流式分选等方法进行纯化,成功获得PRV-WT-ΔTK-mCherry-ΔgE-GFP重组毒。2.利用Cre/Lox重组系统将重组病毒中的荧光基因敲除,通过低熔点琼脂糖噬斑纯化,成功获得PRV-WT-ΔTK-ΔgE双基因缺失毒。3.使用不同剂量的PRV-WT-ΔTK-ΔgE双基因缺失毒治疗骨髓瘤模型,结果显示PRV双基因缺失毒可延长骨髓瘤模型小鼠的存活时间。第二部分研究内容为敲除HSV-1双拷贝的神经毒力基因γ34.5,使得该病毒只能在肿瘤来源的细胞中复制,同时利用肿瘤特异性启动子(hTERT)全长或其核心区(hTERT hexin)表达标签蛋白(HaloTag)、膜蛋白(TM)及荧光蛋白(mCherry),直接通过观察荧光来确定样品中有无肿瘤细胞,以期达到肿瘤细胞早期检测的目的。主要结果概括如下:1.利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除HSV-1病毒γ34.5基因,并利用同源重组修复机制成功将带有红色荧光蛋白(mCherry)的同源重组片段插入HSV-1病毒基因组中。2.利用低熔点琼脂糖噬斑成功纯化获得四株HSV-1荧光蛋白重组毒。其中重组毒HSV-1-hTERT-TM-HaloTag-mCherry-polyA和HSV-1-hTERT(hexin)-TM-HaloTag-mCherry-polyA可初步用于肿瘤的早期检测。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9和Cre/Lox基因编辑系统成功改造PRV和HSV-1两种病毒,获得PRV-WT-ΔTK-ΔgE双基因缺失毒和HSV-1荧光蛋白重组毒,为肿瘤早期检测和治疗提供重组病毒工具和一定的理论基础。