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沼气发酵是有机物在无氧环境下经微生物分解,将其中一部分碳素物质转化为甲烷和二氧化碳的生物化学过程。这一过程涉及多种微生物相互协调,联合交替,极为复杂。在不同发酵阶段,微生物的种类、数量和代谢活性均有变化,各微生物种群的代谢及相互作用直接影响沼气发酵的效率。本文研究了秸秆沼气干发酵各阶段微生物群落结构及其动态变化规律,以及发酵温度对干发酵过程的影响,探讨了微生物群落与基质特性之间的关系,旨在为优化秸秆沼气干发酵工艺,提高产气效率提供理论依据。1.采用物理、化学以及酶处理的细胞破壁方法,提取秸秆沼气干发酵基质中微生物总DNA,对其纯度和得率进行了比较。结果表明：采用冻融处理和酶处理相结合的破壁处理方法最为有效,DNA纯度(A260／A280)和得率分别达到1.392±0.027和0.143±0.016mg/g; DNA纯化试剂盒纯化DNA粗提液,比吸附剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)纯化的纯度提高了34.6%,但A260／A280仍在1.8以下,未能达到利用PCR分析法对微生物进行定量的要求,因此不能作为本实验中微生物定量测定的有效方法。2.优化了荧光原位杂交技术(FISH)定量测定秸秆厌氧干发酵基质中微生物的样品预处理条件,并在最优条件下做了验证性实验。结果表明：使用无水乙醇作为清洗液,FISH样品的荧光信号强度和丰度比用PBS清洗液(磷酸缓冲盐溶液)时有显著提高；样品预处理过程中加无菌玻璃珠震荡能提高微生物的分散度,从而提高FISH技术对秸秆厌氧发酵基质中微生物定量的准确性；采用离心转速为13000r/min时,微生物菌体收集率提高,而且还能保证完好的细胞形态,为后续的FISH杂交奠定基础。3.以多聚甲醛固定时间、热固定时间、乙醇脱水时间、杂交温度、杂交时间为试验因素进行二次回归正交旋转组合试验,对FISH定量检测玉米秸秆厌氧干发酵基料中微生物的最佳杂交条件进行了优化。结果表明：最佳的杂交试验条件为多聚甲醛固定时间18h、热固定时间15min、乙醇脱水时间3min、杂交温度44℃、杂交时间1.5h。在该试验条件下观察的荧光显微图像菌量最多,荧光信号最为强烈,且菌体分辨清晰。4.研究了温度对玉米秸秆厌氧干发酵基质特性及微生物群落结构变化规律的影响,探讨了基质特性与微生物群落结构之间的关系。结果表明：37℃和55℃条件下沼气发酵启动的均较快,乙酸化和甲烷化很快达到平衡,整个过程未出现明显的酸积累,反应体系的pH值和碱度变化较平稳,pH始终维持在适宜甲烷化菌生长的范围；20℃下由于甲烷化菌生长代谢缓慢,不能及时将产生的有机酸转化成甲烷,造成了一定的酸积累,而过度的酸积累又进一步抑制了甲烷化菌的生长繁殖和代谢,导致整个发酵过程中CH4含量始终处于较低水平；37℃和55℃下的微生物群落结构有明显差异,37℃乙酸甲烷菌数量变化较明显,且远远高于氢甲烷菌的数量,而55℃下氢甲烷化菌的数量占优势,说明37℃和55℃下产生甲烷的主要菌群分别是乙酸甲烷菌和氢甲烷化菌；在发酵前期,各类甲烷化菌的数量变化不明显,起主导作用的微生物是产酸型的细菌,它们将大分子有机物质快速分解成小分子酸,再将小分子酸进一步分解成丙酸、乙酸、丁酸；低温(20℃)、中温(37℃)和高温(55℃)发酵时,甲烷化菌的数量分别在第24天、第12天和第6天达到最大。由此可见随着温度的升高可使发酵周期缩短,提前达到峰值,大大提高了发酵效率和产气率。