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背景和目的:问号钩端螺旋体(简称钩体)感染引起的钩端螺旋体病是世界范围流行的自然疫源性人兽共患病。问号钩体无外毒素，所产生的溶血素、细胞毒性因子和脂多糖等均不能解释其感染时的病理学改变，故问号钩体致病机制至今不明。我们曾报道致病性的问号钩体能以菌体一端或两端黏附宿主细胞，腐生性的双曲钩体则否，提示问号钩体与宿主细胞的相互作用可能涉及其致病机制。已知不少病原菌主要通过Ⅲ型分泌系统(T3SS)作用于宿主细胞，诸如黏附细胞、形成针形结构向胞内注入毒力因子、干扰及损伤细胞等。有文献报道，鞭毛结构蛋白也经T3SS分泌，某些鞭毛相关蛋白则是T3SS家族成员。近年发现问号钩体具有较为完整的鞭毛组装系统，相关蛋白编码基因连续排列在大染色体中形成毒力岛样结构，其中鞭毛相关蛋白FliH、FliI、FIiY和FliN等与鼠疫耶尔森菌T3SS的Ysc蛋白高度同源。因此，上述鞭毛相关蛋白在问号钩体致病过程中的作用是有待于研究的重要课题。
本研究中，我们克隆并构建问号钩体黄疸出血群赖型赖赖株fliH、fliI、fliY和fliN基因及其原核表达系统，制备了重组表达产物．rFliH、rFliI、rFliY和rFliN的抗血清，并采用免疫电镜技术对上述鞭毛相关蛋白进行了膜定位，以期为深入研究问号钩体鞭毛相关蛋白的致病性以及T3SS在问号钩体致病过程中的实际作用奠定基础。
实验方法:以苯酚．氯仿法提取的问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板，甩PCR扩增全长fliH、fliI、FliY和fliNa基因片段，T-A克隆后测序，继而构建上述目的基因克隆的原核表达系统。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检查重组蛋白rFliH、rFliI、rFliY和rFliN的表达情况，Ni-NTA亲和层析法提纯目的表达产物。皮下免疫家兔获得4种目的重组蛋白抗血清，用ELISA和Western Blot分别检测抗血清效价并了解抗血清与相应抗原结合的能力。采用免疫电镜技术对FliH、FliI、FliY和FliN进行定位。
结果:PcR扩增获得大小分别为924、1365、1065和318bp的全长fliH、fliI、fliY和fliN基因片段，与报道的序列比较，其核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％。所构建的原核表达系统均能有效地表达目的重组蛋白，其产量均约为20％。rFliH、rFliI、rFliY和rFliN蛋白免疫家兔后能产生抗体，其兔抗血清ELISA效价达到1：100000以上，并分别能识别相应重组蛋白而出现明显的Western杂交条带。FliH、FliI、FliY和FliN蛋白分布于问号钩体内膜、外膜或内外膜之间。
结论:本研究成功地构建了能高效表达问号钩体鞭毛相关蛋白FliH、FliI、FliY和FIiN的原核表达系统，并获得了能有效识别上述蛋白抗原的高效价抗血清。鞭毛相关蛋FliH、FliI、FIiY和FIiN是问号钩体内膜或外膜蛋白成分。