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目的:构建结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3原核表达载体,获得Hsp16.3蛋白,并应用生物信息学技术对结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3进行分析,获取该基因的相关信息。 方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增Hsp16.3基因,以PET28a质粒为载体,构建重组质粒PET28a-Hsp16.3,测序正确后,转入宿主菌BL21(DE3)进行诱导表达。表达的融合蛋白经SDS-PAGE,WesternBlot分析鉴定,并通过镍柱进行亲和层析纯化,表达蛋白分子质量约17kD能被结核杆菌16kD单克隆抗体和小鼠抗HisTag单克隆抗体识别。利用Pmtparam,Protseale,HMMTOP,TMHMM,GOR4,ProtFun等软件,进行生物信息学分析结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3的氨基酸组成、理论等电点、结构域、疏水性、跨膜区、糖基化位点、磷酸化位点及二级结构等。 结果:成功构建了Hsp16.3原核表达载体PET28a-Hsp16.3,并在宿主菌BL21(DE3)中表达。生物信息学分析结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3白分子式为:C716H1131N197O225S4,分子量为16227.2,理论等电点为5.00。该蛋白氨基酸序列中含有α-螺旋(Alphahelix)46处,延伸链(Extendedstrand)25处,无规则卷曲(Randomcoil)73处及5个磷酸化位点;4个O-糖基化位点;1个前肽裂解预测位点;该蛋白是一个亲水性不稳定蛋白,无跨膜区,可能参与重要的能量代谢及免疫反应。 结论:1.Hsp16.3基因克隆入宿主菌中并成功表达。 2.经过纯化得到纯度较高的目的蛋白,为Hsp16.3的进一步研究奠定基础。 3.生物信息学分析显示该蛋白是一个亲水性不稳定蛋白,无跨膜区,可能参与重要的能量代谢及免疫反应。