【摘 要】
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目的:探讨PINK1/Parkin通路介导下茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞对急性肝衰竭大鼠线粒体自噬的作用机制。方法:通过检测各组大鼠生化指标、病理组织、线粒体结构、线粒体膜电位、PINK1（丝氨酸/苏氨酸激酶）/Parkin（E3泛素连接酶）等相关蛋白来探讨急性肝衰竭大鼠线粒体自噬的作用机制。1.骨髓间充质干细胞（BMSCs）的制备:将培养的BMSCs经流式细胞仪鉴定后用于茵陈四苓联合BMSC
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目的:探讨PINK1/Parkin通路介导下茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞对急性肝衰竭大鼠线粒体自噬的作用机制。方法:通过检测各组大鼠生化指标、病理组织、线粒体结构、线粒体膜电位、PINK1（丝氨酸/苏氨酸激酶）/Parkin（E3泛素连接酶）等相关蛋白来探讨急性肝衰竭大鼠线粒体自噬的作用机制。1.骨髓间充质干细胞（BMSCs）的制备:将培养的BMSCs经流式细胞仪鉴定后用于茵陈四苓联合BMSCs组（简称联合组）、BMSCs组的干预治疗。2.流程:将60只SD雄性大鼠随机均分为A组（正常组）、B组（茵陈四苓联合BMSCs组）（简称联合组）、C组（茵陈四苓组）（简称中药组）、D组（模型组）、E组（复方甘草酸苷组）、F组（BMSCs组）。各干预组腹腔注射硫代乙酰胺（TAA）后,A、D组:0.9%氯化钠溶液（0.9%Nacl）灌胃（早晚1次/天）;B组:茵陈四苓颗粒溶液灌胃（早晚1次/天）,尾静脉注射BMSCs悬液;C组:茵陈四苓颗粒溶液灌胃（早晚1次/天）;E组:复方甘草酸苷片溶液灌胃（早晚1次/天）;F组:0.9%Nacl溶液灌胃（早晚1次/天）,尾静脉注射BMSCs悬液;除E、F组外各组尾静脉注射0.9%Nacl溶液。3、检测:各组大鼠干预72h后麻醉,腹主动脉采血,采集标本。检测肝功、凝血的指标;HE染色观察肝组织病理切片;透射电镜观察肝组织中线粒体结构及自噬小体:流式细胞仪检测肝组织线粒体膜电位水平（△Ψm）;Western Blot法检测相关自噬蛋白PINK1/Parkin、P62（接头蛋白）、LC3（微管相关蛋白1A/1B-轻链3）等蛋白的表达。结果:1、经流式细胞仪鉴定表明实验所培养的第3代BMSCs的标志物中CD34（0.86%）、CD45（0.14%）低表达,CD90（99.56%）、CD29（97.95%）高表达;2、大鼠肝功、凝血功能结果示:与D组相比,各干预组指标有所好转,其中B组指标更明显（P＜0.05）;3、大鼠肝脏病理形态观察:D组肝组织可见大量炎性及淋巴细胞浸润,肝细胞呈弥漫性坏死,且坏死区肝细胞结构模糊崩解、肝小叶结构紊乱,提示肝损伤严重;其中B组损伤程度更小,可见新生肝细胞;4、透射电镜观察结果:D组肝细胞胞浆中多数线粒体已发生肿胀、溶解甚至消失已发生凋亡;其中B组的线粒体仅轻度肿胀,结构仍存在,损伤程度更小;5、肝线粒体膜电位的检测结果:D组提示膜电位损伤严重,（P＜0.05）;各干预组阳性百分比均无上升,提示线粒体凋亡程度较轻,其中B组膜电位最为稳定,说明茵陈四苓颗粒联合BMSCs能稳定肝线粒体膜电位,减轻其凋亡程度;6、蛋白印迹法检测结果:PINK1、Parkin、LC3、p62蛋白表达水平:与D组比较,各干预组PINK1、Parkin、LC3蛋白表达量显著升高,其中以B组上升明显（P＜0.05）,与D组比较,B、C组p62蛋白量降低（P＜0.05）,以B组最明显（P＜0.05）。结论:1、茵陈四苓颗粒联合BMSCs能有效降低肝功能及凝血相关指标、减轻肝脏组织病理损伤程度;2、茵陈四苓颗粒联合BMSCs干预能通过稳定膜电位来改善线粒体功能及活性,抑制线粒体损伤,进而影响线粒体自噬,并且可能激活PINK1/Parkin信号通路来上调自噬蛋白LC3及下调P62,有效促进肝线粒体自噬,清除受损线粒体,维持线粒体功能的正常运转,进而保护肝脏功能,改善肝衰竭。
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