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目的:1.建立一种适宜的海马神经元体外培养方法,以及海马神经元糖氧剥夺/复氧模型。2.通过建立糖氧剥夺/复氧模型,探究EphA4受体对脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）及前体BDNF（pro-BDNF）表达的影响。方法:1.原代海马神经元体外培养实验。采用雌雄不限1-3d的SD型大鼠乳鼠,将其海马组织分离,培养海马原代神经元。将神经元随机分为胶质细胞完全抑制组、不完全抑制组和不抑制组。培养7d后,按照神经元生长情况,选取最合适的培养条件进行后续的神经元培养。2.糖氧剥夺/复氧（oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）模型制备。Control组在正常细胞培养箱的中继续培养;OGD/R组在缺氧缺糖环境中进行处理,分为9组,糖氧剥夺0.5、1.0和1.5h后再复氧24h,36h和48h,具体分为:OGD0.5h/R24h组、OGD0.5h/R36h组、OGD0.5h/R48h组、OGD1h/R24h组、OGD1h/R36h组、OGD1h/R48h组、OGD1.5h/R24h组、OGD1.5h/R36h组和OGD1.5h/R48h组。按照神经元损伤程度和存活率选取最合适的OGD/R条件用于后续实验。3.CCK-8法检测神经元存活率。将海马神经元接种到96孔培养板上,分为OGD0.5h/R24h组、OGD0.5h/R36h组、OGD0.5h/R48h组、OGD1h/R24h组、OGD1h/R36h组、OGD1h/R48h组、OGD1.5h/R24h组、OGD1.5h/R36h组和OGD1.5h/R48h组,每组设置3个复孔,每孔100μl培养体系,细胞约为6×103个/孔。培养7天,OGD/R处理每组的对应时间,每孔加入10μl CCK-8溶液。37℃保持温度恒定,孵育4h。450nm测定吸光度值。4.乳酸脱氢酶（LDH）测定神经元活力。根据神经元各组缺氧复氧完成时间,收集其培养液,检测各组海马神经元培养液中乳酸脱氢酶的含量。450nm测定吸光度值。5.根据实验结果,在后续实验中选取OGD1h/R36h作为模型组。6.EphA4-Fc拮抗EphA4受体功能。将配好的EphA4-Fc溶液加入神经元培养液中,神经元培养液内EphA4-Fc浓度保持在4μg/ml。每次换液,重新加入EphA4-Fc溶液,保证培养液内EphA4-Fc浓度恒定。7.应用Western blot技术检测pro-BDNF蛋白质和BDNF蛋白质。实验检测对照组、OGD/R处理、以及给予EphA4-Fc拮抗EphA4受体功能后,pro-BDNF蛋白和BDNF蛋白质的变化。8.应用RT-qPCR法检测BDNF m RNA的表达。将培养至成熟的原代海马神经元按照实验所需分组,做不同条件处理。共培养10d后,提取总RNA,设计BDNF多种启动子引物,运行RT-qPCR扩增程序。计算Bdnf基因转录本的相对表达量。结果:1.结果显示:培养神经元时如果不抑制胶质细胞的生长,由于胶质细胞分裂迅速,当神经元培养至第7天时,显微镜下难以观察到海马神经元的长势和状态,并且此条件下培养的神经元数量相对较少,神经元纯度较低。当完全抑制胶质细胞时,胶质细胞基本不生长,此时神经元数量较多,纯度可达95%以上。但此培养条件下的胶质细胞数量过少,更适用于膜片钳等实验技术。当部分抑制胶质细胞时,培养的海马神经元状态均一良好,胞体圆润呈三角型,边缘光滑,胶质细胞数量与海马神经元数量接近1:1,同时保留了胶质细胞与神经元间的信息交流。此培养条件更实用于本实验。2.采用常规方法培养海马神经元时,对其生长状态和形态进行观察。发现神经元长势良好,贴壁性强。神经元的树突粗壮而且较长,分布广泛,彼此交联,形成密集的网状结构。神经元的胞体呈椎体型,折光性较强。在对神经元糖氧剥夺0.5h后,光学显微镜下观察到神经元胞体肿胀膨大。对神经元糖氧剥夺1h后,神经元的树突变细而且变短,分布范围开始缩小。神经元的胞体更加膨大,并且折光性减弱。糖氧剥夺1.5h后,神经元在显微镜下开始有圆球状出现,这是由于神经元的树突断裂造成。神经元的贴壁能力减弱,开始出现聚集现象。此时的神经元容易从细胞板上脱离,部分细胞开始脱落。3.LDH和CCK-8的实验结果表明:OGD0.5h/R24h组、OGD0.5 h/R36h组和OGD0.5 h/R48h组LDH含量和细胞存活率相对于正常对照组无显著变化。OGD1h/R24h组和OGD1h/R36h组LDH含量和细胞存活率无显著差异,OGD1h/R48h组LDH含量显著升高,细胞存活率显著降低。OGD1.5h/R24h组和OGD1.5h/R48h组LDH含量显著升高,细胞存活率显著降低,OGD1.5h/R36h组LDH无显著变化,细胞存活率显著降低。4.Western blot结果显示:与对照组相比,OGD1h/R36h组pro-BDNF蛋白和BDNF蛋白达显著的降低。与OGD1h/R36组相比,OGD1h/R36h+EphA4-Fc组pro-BDNF蛋白表达和BDNF蛋白表达显著升高。5.RT-qPCR结果显示:与对照组相比,给予EphA4-Fc后,包含外显子I、IV和VI的Bdnf基因转录本的表达显著降低。与对照组相比,OGD1h/R36h组包含外显子I、IV和VI的Bdnf基因转录本的表达显著升高。与OGD1h/R36h组相比,OGD1h/R36h+EphA4-Fc组包含外显子I、IV和VI的Bdnf基因转录本的表达显著降低。包含外显子IIc的Bdnf基因转录本表达在各组均无显著变化。结论:1.不完全抑制胶质细胞生长时,原代培养海马神经元长势良好,结果易于观察。2.OGD1h/R36h后,神经元树突缩短变细,神经元之间连接的网状结构被破坏,变稀疏,神经元活力降低,但存活率较高,利于后续实验的进行。3.OGD1h/R36h后,海马神经元pro-BDNF蛋白和BDNF蛋白表达降低与包含外显子I、IV和VI的Bdnf基因转录本表达升高相关。拮抗EphA4受体功能引起的pro-BDNF和BDNF蛋白表达增加,与包含外显子I、IV和VI的Bdnf基因转录本表达降低相关。