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实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis.EAE)是人类多发性硬化(multiple sclerosis, MS)的动物模型,是典型的T细胞应答诱导的自身免疫性疾病。在抗原肽MOG35-55诱发的C57BL/6小鼠EAE模型中,T细胞识别表位十分明确,可诱导相应的自身反应性CD4+T细胞应答,造成组织损伤。本研究中,我们选择MOG35-55特异性CD4+T细胞作为干预对象,构建并制备出可与上述CD4+T细胞特异性结合的可溶性pMHC二聚体(MOG35-55/I-Ab二聚体),并将其应用于EAE小鼠模型。体外与体内的实验结果表明,针对MOG35-55特异性CD4+T细胞的可溶性MOG35-55/I-Ab二聚体可以抑制抗原特异性自身反应性T细胞的增殖,抑制介导EAE的Thl与Th17细胞的扩增,从而阻断小鼠EAE的发生。其可能的机制为下调抗原特异性T细胞CD3-TCR的表达及上调抑制性细胞因子mTGF-β与IL-10。总之,本研究证明可溶性pMHC二聚体对于单肽诱发的小鼠EAE模型可以起到有效的治疗作用,为治疗自身免疫性疾病提供新的思路。论文共包括二个部分,其主要内容与结果如下：一、可溶性I-Ab/Fc的构建、表达与鉴定在本室之前构建的共价连接MOG35-55肽段的I-Ab/Fc二聚体的基础上,通过重叠PCR技术获得不含MOG35-55肽段的I-Ab/Fc二聚体,并且在起始密码子上游引入了kozak序列。通过杆状病毒-昆虫表达系统进行表达以及葡萄球菌蛋白A(SPA)柱纯化,得到可溶性I-Ab/Fc二聚体融合蛋白(简称I-Ab二聚体)经ELISA检测及Western blot鉴定,证明纯化后的I-Ab二聚体具有正确的构象及分子量大小,并且表达水平优于本室之前构建的共价连接MOG肽的二聚体蛋白。二、可溶性MOG35-55/I-Ab二聚体体外功能研究与机制探讨本研究分别采用MOG35-55抗原肽免疫而发生EAE的野生型C57BL/6小鼠(简称WT EAE小鼠)以及未经抗原肽免疫的2D2转基因小鼠的脾脏淋巴细胞作为两种效应细胞,评价加载MOG35-55肽段的I-Ab二聚体(称为MOG35-55/I-Ab二聚体)对于MOG35-55特异性自身反应性T细胞的抑制作用。结果显示：可溶性MOG35-55/I-Ab二聚体可以显著抑制自身反应性CD4+T细胞对于MOG35-55抗原肽刺激的特异性增殖,并且显著下调两种来源的自身反应性CD矿T细胞分泌炎性因子IFN-γ和IL-17的水平。利用2D2转基因小鼠来源的T细胞进一步探索MOG35-55/I-Ab二聚体对于特异性CD4+T细胞的干预机制,结果发现：可溶性MOG35-55/I-Ab二聚体可以特异性下调2D2T细胞表面CD3-TCR复合物的表达水平；并且,这群由MOG35-55/I-Ab二聚体诱导增多的CD3-TCR低表达细胞显著上调了膜型TGF-β(mTGF-β)与IL-10的表达水平。我们推测：CD3-TCR的下调表达以及两种抑制性细胞因子：mTGF-β与IL-10的上调表达共同参与了可溶性MOG35-55/I-Ab二聚体的干预机制。三、可溶性MOG35-55/I-Ab二聚体治疗IOG35-55诱发的小鼠EAE在体外功能实验的基础上,将MOG35-55/I-Ab二聚体应用于MOG35-55诱发的EAE小鼠模型。结果表明：MOG35-55/I-Ab二聚体显著地减轻了EAE的临床症状,并且缓解了中枢神经系统的炎性浸润与脱髓鞘现象。而未加载MOG肽的空I-Ab二聚体组在EAE小鼠发病程度、组化得分上都没有明显改善,说明MOG35-55/I-Ab二聚体可以以抗原依赖性的方式起到良好的治疗效果。另外,MOG35-55/I-Ab二聚体处理组小鼠脾脏及淋巴结中,致脑炎性Th1与Th17细胞显著少于对照组小鼠,并且在CD8+T细胞中,也观察到IFN-γ和IL-17阳性细胞显著减少。说明MOG35-55/I-Ab二聚体对EAE小鼠的治疗作用,不仅依赖于其对自身反应性CD4+T细胞的特异性抑制,并且通过Th细胞的作用,影响到效应性CD8+T细胞的功能。本研究的创新点和意义：1.首次在识别表位明确的MOG35-55诱发的EAE动物模型中,研究可溶性pMHC二聚体干预自身免疫病发生、发展的作用,为可溶性pMHC二聚体诱导特异性免疫耐受、阻断自身免疫性疾病发生提供直接的体内实验依据。2.利用2D2转基因小鼠来源的T细胞进一步研究可溶性MOG35-55/I-Ab二聚体抑制自身反应性T细胞的机制,发现可溶性MOG35-55/I-Ab二聚体可以诱导出一群mTGF-β与IL-10高表达,CD3-TCR特异性下调表达的CD4+T细胞群体。这群细胞对于诱导特异性免疫耐受的具体作用有待进一步深入探索,有望为治疗自身免疫性疾病提供新的思路。