背景：粘多糖病Ⅱ型（mucopolysaccharidosis typeⅡ，MPSⅡ，OMIM309900），又名Hunter综合征，由IDS基因缺陷引起溶酶体内艾杜糖-2-硫酸酯酶（iduronate-2-sulfatase,IDS,EC3.1.6.13）活性降低或缺乏而导致，是一种罕见的X连锁隐性遗传溶酶体贮积病。本病是粘多糖病的常见类型之一，由加拿大外科医生Charles Hunter于1917年首次报道。IDS酶活性缺乏导致硫酸类肝素（heparan sulfate，HS）和硫酸皮肤素（dermatan sulfate，DS）不能降解而蓄积在溶酶体内，并沉积在人体心脏瓣膜、肺和气管、神经组织、骨骼系统、肝脾脏等组织器官，导致组织器官功能异常，同时过多的HS与DS可从尿液大量排出。　　MPSⅡ型是中国最常见的粘多糖病，临床表现具有高度的异质性。根据发病年龄、中枢神经系统是否受累及患儿寿命，临床上分为重型（MPSⅡA）和轻型（MPSⅡB）两种临床表型。重型患者临床特点为：2~4岁起病，具有典型的面部特征、舌体肥大、关节僵硬、多发骨发育不良、肝脾肿大、疝、心脏瓣膜病、上呼吸道梗阻、智力低下等表现，不伴角膜混浊，患者常因呼吸道梗阻、心脏衰竭于10~20岁死亡。轻型患者发病晚、无明显智力障碍、疾病进展缓慢，可存活至50~60岁。　　外周血白细胞或培养的皮肤成纤维细胞IDS酶活性显著降低是确诊的重要依据，IDS基因分析可从分子水平进一步确诊。早期诊断，早期进行重组人艾杜糖硫酸酯酶（如Elaprase(R)）替代治疗可显著改善患者的临床症状，提高患者的生活质量，但酶替代治疗不能预防或治疗中枢神经系统损伤。联合鞘内注射艾杜糖-2-硫酸酯酶可能改善神经系统症状，其他治疗如分子伴侣疗法、底物减少疗法、基因治疗等尚处于动物实验阶段。因此，MPSⅡ型是严重危害儿童健康的致死致残性遗传代谢病，探索该病的分子发病机制，对明确分子诊断、对高危家庭进行遗传咨询与产前筛查，预防疾病再发风险具有重要意义。　　IDS基因位于染色体Xq27.3～q28，含9个外显子，转录一条长2504bp的mRNA，开放阅读框为1650bp，编码550个氨基酸的多肽链前体。距IDS基因5′端上游约20kb的位置，存在1个IDS假基因(IDS P1，IDS2），易与IDS基因发生同源重组引发各种新的缺失、插入突变而导致疾病的产生。根据人类基因突变数据库（HGMD），目前已报道IDS基因突变共534种，包括点突变、剪接突变、小缺失小插入突变、大片段缺失及插入/重复突变、基因重排、indel突变等，其中以点突变及小缺失突变最多见。突变大多数位于Exon3、7、8、9，以第9外显子最多见。大部分突变属于“私人突变”，只有极少数突变具有种族或地域特异性。突变类型多而复杂、新突变比率高。　　从1990年WilsonPJ等学者成功克隆IDS基因全长以来，关于IDS基因突变导致IDS酶结构及功能变化的研究越来越深入，国外学者多结合体外瞬时表达及三级结构预测的方法来研究IDS的发病机制，国内MPSⅡ型研究起步相对较晚，有关该病分子遗传学特征的知识多数来自于国外研究，新突变体外功能学研究资料非常罕见。因此，为进一步明确IDS基因突变的分子发病致病机制，为遗传咨询和产前诊断建立提供基础，同时为了加深对IDS酶蛋白结构及催化机制的认识，为将来进一步研发新药、探索新治疗方案提供有价值的资料，进行IDS基因突变的体外功能学研究非常必要。　　目的：探讨MPSⅡ型患儿的IDS基因突变特点，建立IDS基因体外瞬时表达体系，对新突变进行体外功能学鉴定。　　方法：2008年1月至2014年12月广州市妇女儿童医疗中心遗传与内分泌科根据外周血白细胞IDS酶活性检测确诊MPSⅡ型患儿共44例，均为男性，确诊年龄1y2m~12y7m，分别来自42个无血缘关系的家庭。提取外周血基因组DNA，采用PCR直接测序法对IDS基因9个外显子及两侧侧翼序列进行突变分析，检出突变后对先证者母亲DNA进行相关位点分析，并以50例健康男性儿童作对照。对新突变进行12个不同物种突变位点氨基酸保守性分析，并使用SIFT、Polyphen-2软件在线分析进行蛋白质功能预测；以表达增强型绿色荧光蛋白的质粒pcDNA3.1-EGFP为空载体，构建pcDNA3.1-IDS-EGFP野生型载体，体外定点诱变成新突变位点相应的突变型载体，转染293FT细胞，建立IDS基因体外真核表达体系，对新突变的致病性进行鉴定。提取转染后的293FT细胞总蛋白，检测IDS酶及参考酶β-半乳糖苷酶活性，同时进行Western blot分析。　　结果：1.IDS基因突变分析结果显示，42例MPSⅡ型先证者中共检出35种突变，其中18种为已知致病突变，15种为新突变（p.Q81R，p.R110G，p.W153R，p.E166X，p.S349R，p.L40del，p.P260PfsX77，p.E274EfsX4，c.1181-1_1192del13，p.P157PfsX5，p.L241FfsX15，p.468_469ins3，p.L482FfsX1，p.A250TfsX28，c.880-1G＞C），另考虑IDS全基因缺失、外显子3~6缺失各1例，突变检出率为93.2%(39/42)。其中点突变占64.1%（25/39）。点突变主要分布在外显子3（7/25，28%）、外显子8（6/25，24%）及外显子9（5/25，20%）。其中26例先证者母亲进行了IDS基因突变分析，21例（80.8%）为相应突变携带者。15种新突变在50例健康人均未检出。　　2.在15种新突变中,剪接突变（c.880-1G＞C）、无义突变（p.E166X）、小缺失突变（p.P260PfsX77，p.E274EfsX4，c.1181-1_1192del13）及小插入突变（p.P157PfsX5，p.L241FfsX15，p.L482FfsX1）导致其编码的IDS前体多肽链发生截短或结构改变，推测上述改变影响酶的二、三级结构及酶蛋白的稳定性和催化活性。对4种错义突变（p.Q81R，p.R110G，p.W153R，p.S349R）、1种缺失突变（p.L40del）、1种插入突变（p.468_469ins3）及1种indel突变（p.A250TfsX28）共7种突变进行生物信息学分析及体外功能鉴定。新突变p.Q81R，p.R110G，p.W153R，p.S349R，p.L40del，p.468_469ins3，其突变位点氨基酸在12个不同物种间高度保守；其中新错义突变使用SIFT及Polyphen-2软件进行评分，SIFT评分接近0，Polyphen-2评分接近1，均提示致病可能性大。　　3.构建pcDNA3.1-IDS-EGFP真核表达质粒经测序分析鉴定。体外定点诱变构建（p.Q81R，p.R110G，p.W153R，p.S349R，p.L40del，p.468_469ins3，p.A250TfsX28）7种突变型质粒。空载体、野生型及突变型载体转染293FT细胞48h后，在荧光显微镜下观察见各组细胞均见明亮绿色荧光，转染后293FT细胞IDS酶活性检测结果显示，空载体组为31.51±6.23nmol/mg.4h，野生型载体组为978.29±68.10nmol/mg.4h，7种突变型载体组IDS酶活性介于28.38±2.89~34.54±6.38nmol/mg.4h之间。参考酶β-半乳糖苷酶酶活性在155.32±7.99~186.10±11.24nmol/mg.h之间。Western blot分析结果提示，空载体、野生型及7种突变型载体转染的293FT细胞内参GAPDH表达一致，野生型载体转染的293FT细胞有75kDa的IDS前体蛋白及55kDa、45kDa的IDS成熟蛋白表达，7种突变型载体转染的293FT细胞仅见少量75kDa的IDS前体蛋白表达，空载体无IDS蛋白表达。　　结论：1．通过IDS基因突变分析，在42例MPSⅡ型先证者中共检出35种不同的突变，其中18种为已知致病突变，15种为新突变(p.Q81R，p.R110G，p.W153R，p.E166X，p.S349R，p.L40del，p.P260PfsX77，p.E274EfsX4，c.1181-1_1192del13，p.P157PfsX5，p.L241FfsX15，p.468_469ins3，p.L482FfsX1，p.A250TfsX28，c.880-1G＞C)，以及IDS全基因缺失、外显子3~6缺失各1例，提示IDS基因具有突变种类多、新突变多的特点。本研究丰富了IDS基因突变谱。　　2．首次成功构建了含人IDS基因真核表达载体pcDNA3.1-IDS-EGFP，并在转染的293FT细胞中获得了IDS基因的高效表达，为IDS基因新突变体外功能学研究提供了分子平台。　　3．成功构建了7种新突变载体，经293FT细胞瞬时表达研究证实，新突变p.Q81R，p.R110G，p.W153R，p.S349R，p.L40del，p.468_469ins3，p.A250TfsX28均为致病性突变，其临床表型均为重型。