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中药雷公藤为卫矛科植物雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.f.的干燥根，临床上广泛用于治疗类风湿性关节炎、肾病综合征及红斑狼疮等自身系统免疫性疾病，疗效确切，但毒副作用明显，其中肝损伤最为严重。雷公藤甲素是雷公藤最主要的活性及毒性成分，具有良好的免疫抑制、抗炎及抗肿瘤等生物活性，但明显的肝毒性以及较窄的治疗窗限制了其开发和临床应用。因此，研究雷公藤甲素的肝损伤作用机制，有利于雷公藤肝损伤机制的最终阐明，对于雷公藤及雷公藤甲素的安全合理应用和规避其毒性具有重要意义。本研究结合体内动物实验和体外细胞实验，初步探究内质网应激直接介导肝细胞凋亡以及通过NLRP3炎症小体激活介导肝细胞焦亡在雷公藤甲素肝损伤中的作用；并采用代谢组学及转录组学技术，深入挖掘雷公藤甲素肝损伤作用通路，为新靶点的寻找提供可行方向。
第一部分内质网应激介导的细胞死亡在雷公藤甲素肝损伤中的作用机制研究
目的：以组织病理学、氧化应激作为观测指标，利用分子生物学及细胞生物学技术，研究内质网应激直接介导的细胞凋亡以及通过NLRP3炎症小体激活介导的细胞焦亡在雷公藤甲素肝损伤中的作用。
方法：
1雷公藤甲素肝损伤的量毒和时毒关系研究：选用成年雄性C57BL/6N小鼠，灌胃给予雷公藤甲素，分别观察不同剂量雷公藤甲素(0.2 mg/kg、0.4 mg/kg、0.6 mg/kg、0.8 mg/kg )作用24h时和雷公藤甲素(0.8mg/kg)作用2h、6h、12h、24h、48h及72h时的肝损伤。以血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和谷氨酸氨基转移酶(AST)的水平和苏木精-伊红(HE)染色法检测肝组织病理变化评价肝损伤程度。
2RIPK3介导的坏死性凋亡在雷公藤甲素肝损伤中的作用研究：选用成年C57BL/6N背景的RIPK3敲除小鼠和wild-type小鼠，灌胃给予雷公藤甲素(0.8mg/kg)作用24h，观察两组小鼠的肝损伤差异。
3内质网应激直接介导的细胞凋亡和通过NLRP3炎症小体激活介导的细胞焦亡在雷公藤甲素肝损伤中的作用研究：选用成年雄性C57BL/6N小鼠，依据量毒和时毒关系研究结果，选取0.8mg/kg雷公藤甲素作用24h的肝脏切片及肝组织，采用TUNEL试剂盒及westernblot技术，检测雷公藤甲素肝损伤中细胞死亡方式；采用qPCR及westernblot技术检测肝组织引起肝细胞凋亡及焦亡有关的内质网应激和NLRP3炎症小体通路相关基因(Atf4、Ddit3、Ero1a、Gadd34、Dr5、Trailr2、Bim、Bax、Nlrp3、Pycard、Panx1及Casp1)及蛋白表达(p-Eif2α、p-IRE1α及CHOP)变化；使用内质网应激抑制剂TUDCA和Caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk，观察阻断内质网应激通路及NLRP3炎症小体通路后小鼠肝损伤情况；检测肝组织中GSH和活性氧(ROS)水平，并用C57BL/6N小鼠原代肝细胞，使用不同剂量雷公藤甲素作用，检测引起内质网应激的氧化应激相关基因(Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm6、Gstp1、Gstp2、Gstt2、Mgst1、Nrf2、Hmox1、Gclm、Sod1、Sod2、Cat、Prdx1、Txnrd2及Txnrd3)mRNA的表达情况。
结果：
1低剂量雷公藤甲素(0.2mg/kg和0.4mg/kg)对小鼠血清ALT和AST水平并无显著影响，肝组织切片均无明显肝细胞损伤。随着雷公藤甲素剂量增加，血清ALT和AST水平显著升高，肝组织切片显示肝损伤程度存在剂量相关性。给药后12h内，血清ALT和AST水平及肝组织切片均未产生明显变化；给药48h时ALT及AST水平升至最高。当雷公藤甲素的给药剂量为0.8mg/kg，作用时间为24h时，其肝损伤作用稳定且毒性程度适中。
2与wild-type小鼠组相比，RIPK3-null组小鼠血清ALT与AST水平没有明显差异，肝组织切片显示，肝损伤程度并未有所改善。提示雷公藤甲素导致的肝损伤机制与RIPK3介导的坏死性凋亡无直接关系。
3与空白对照组相比，雷公藤甲素组中执行细胞凋亡的蛋白CASP3和焦亡的蛋白CASP1(p20，p22)显著增加，并且TUNEL结果呈阳性，提示雷公藤甲素可能导致肝细胞凋亡及焦亡；介导细胞凋亡及焦亡的内质网应激和NLRP3炎症小体通路相关基因mRNA及蛋白在雷公藤甲素给药组含量均升高；采用抑制剂TUDCA和Ac-YVAD-cmk均可显著缓解雷公藤甲素肝损伤程度，提示阻断内质网应激及NLRP3炎症小体通路能够降低雷公藤甲素肝损伤；进一步研究发现，雷公藤甲素能够显著降低肝组织GSH，并升高ROS水平，并在体内外均能够抑制GSH合成酶及ROS清除酶相关基因的表达。
结论：雷公藤甲素能够消耗机体GSH并抑制GSH合成酶及ROS清除酶的合成，改变体内氧化还原内稳态，进而导致内质网应激，一方面直接介导肝细胞凋亡，另一方面通过NLRP3炎症小体通路介导肝细胞焦亡。
第二部分雷公藤甲素肝损伤的代谢组学研究
目的：建立基于UPLC-Q-TOFMS的小鼠血清及肝组织代谢组学分析方法，通过分析不同剂量下差异代谢物及代谢通路变化规律，深入探讨雷公藤甲素肝损伤作用机制。
方法：40只成年雄性C57BL/6N小鼠，随机分为5组，每组8只，即空白对照组和不同剂量雷公藤甲素组。给药24h后，处死小鼠，收集血清及肝脏。基于UPLC-Q-TOFMS技术，采用WatersAcquityBEHAmide柱(2.1mm×50mm,1.7μm)在ESI源正负离子模式下对小鼠血清及肝脏样本进行检测，对原始数据进行预处理，并通过多元统计分析，筛选差异代谢物，利用质荷比及二级图谱与在线数据库Metlin、HMDB及PubChem对比，鉴定差异代谢物，利用在线软件MetaboAnalyst4.0及在线通路数据库KEGG对潜在生物标志物进行代谢通路分析。
结果：在血清及肝组织的代谢组学研究中，原始数据通过数据处理及多元统计分析后，筛选并鉴定出77个差异化合物，包括脂类、胆碱类，脂肪酸类、核糖及核酸类等内源性小分子物质。这些差异代谢物主要涉及谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢、泛酸和辅酶A生物合成、甘油磷脂代谢、三羧酸循环、嘧啶代谢、烟酸和烟酰胺代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢及氨基酸代谢等。
结论：本研究采用非靶向代谢组学技术对不同剂量雷公藤甲素作用下小鼠血清及肝组织进行了分析，发现雷公藤甲素能够导致机体多条代谢通路发生改变，氧化应激、脂代谢及氨基酸代谢紊乱起重要作用。为雷公藤甲素肝损伤中生物标志物的最终发现及肝损伤机制的进一步研究提供了指导。
第三部分雷公藤甲素肝损伤的转录组学研究
目的：基于RNA-seq测序技术，对不同剂量雷公藤甲素作用下小鼠肝组织的基因表达谱进行检测，通过分析不同剂量下差异表达基因及毒性通路，从基因层面探讨雷公藤甲素肝损伤作用机制。
方法：40只成年雄性C57BL/6N小鼠，随机分为5组，每组8只，即空白对照组和不同剂量雷公藤甲素组。给药24h后，处死小鼠，收集肝脏。提取肝组织总RNA，进行质量检测，并纯化，采用高通量转录组学测序(RNA-seq)技术，进行mRNA测序并筛选差异表达基因，运用IPA软件对差异表达基因进行毒性作用通路及毒性功能分析，并进行深入的生物信息学分析。
结果：通过对不同剂量雷公藤甲素作用下的基因表达谱进行了检测及深入分析，分别发现133、1234、5839和7312个基因的表达显著改变，差异表达基因数目呈现明显的剂量依赖性。差异表达基因在IPA中富集的通路主要包括：AHR信号、Nrf2介导的氧化应激反应、SAPK/JNK信号、死亡受体信号、凋亡信号巨噬细胞中NO及ROS的生成、LPS/1L介导的RXR功能抑制、肝纤维化/肝星状细胞激活、IL-8信号、NK-κB信号、PPAR信号及肝脏胆汁淤积等通路。
结论：本研究采用高通量转录组学测序(RNA-seq)技术，通过对不同剂量雷公藤甲素作用下小鼠肝脏差异表达基因的毒性作用通路及功能分析，深入探讨了雷公藤甲素肝损伤作用机制。结果表明其主要与肝细胞死亡、炎症反应及代谢紊乱有关。本部分研究为雷公藤甲素肝损伤作用机制研究提供了新的研究策略。
第四部分基于多组学联合分析的雷公藤甲素肝损伤作用机制研究
目的：运用Cytoscape和IPA软件，对0.8mg/kg雷公藤甲素作用下差异代谢物和差异表达基因进行整合分析，并结合体内动物实验，对多组学分析结果进行验证，进一步探讨雷公藤甲素肝损伤作用机制。
方法：
1使用Cytoscape软件对差异代谢物及差异表达基因进行代谢网络分析；随后将差异代谢物和差异表达基因及相应的log2(Fold change)值导入IPA软件中，采用“Coreanalysis”分析功能，对相关代谢物和基因进行相关通路分析。
220只成年雄性C57BL/6N小鼠，随机分为2组，每组10只，即巨噬细胞清除组和对照组。提前分别尾静脉给予巨噬细胞清除组小鼠Clodronateliposomes；给予对照组小鼠Emptyliposomes。两天后，灌胃给予两组小鼠雷公藤甲素。给药24h后，处死小鼠，收集血清及肝脏。测定血清ALT和AST水平，HE染色法检测肝组织病理变化。
结果：
1通过对差异代谢物和差异表达基因数据进行整合分析，发现巨噬细胞中一氧化氮及活性氧的产生通路变化较为显著。
2巨噬细胞清除实验结果表明，与对照组比较，巨噬细胞清除组小鼠给予雷公藤甲素后血清ALT和AST水平未见显著升高，并且肝组织切片显示肝组织结构正常。结果表明巨噬细胞在雷公藤甲素肝损伤中具有重要作用。
结论：本研究采用Cytoscape和IPA软件初步对代谢组学数据和转录组学数据进行了整合分析，构建了差异代谢物和差异表达基因的相互作用网络图，并进行了代谢通路富集分析，推测巨噬细胞在雷公藤甲素肝损伤中具有重要作用。同时结合体内巨噬细胞清除实验，对多组学分析结果进行验证，进一步证明巨噬细胞在雷公藤甲素肝损伤中的作用。
第一部分内质网应激介导的细胞死亡在雷公藤甲素肝损伤中的作用机制研究
目的：以组织病理学、氧化应激作为观测指标，利用分子生物学及细胞生物学技术，研究内质网应激直接介导的细胞凋亡以及通过NLRP3炎症小体激活介导的细胞焦亡在雷公藤甲素肝损伤中的作用。
方法：
1雷公藤甲素肝损伤的量毒和时毒关系研究：选用成年雄性C57BL/6N小鼠，灌胃给予雷公藤甲素，分别观察不同剂量雷公藤甲素(0.2 mg/kg、0.4 mg/kg、0.6 mg/kg、0.8 mg/kg )作用24h时和雷公藤甲素(0.8mg/kg)作用2h、6h、12h、24h、48h及72h时的肝损伤。以血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和谷氨酸氨基转移酶(AST)的水平和苏木精-伊红(HE)染色法检测肝组织病理变化评价肝损伤程度。
2RIPK3介导的坏死性凋亡在雷公藤甲素肝损伤中的作用研究：选用成年C57BL/6N背景的RIPK3敲除小鼠和wild-type小鼠，灌胃给予雷公藤甲素(0.8mg/kg)作用24h，观察两组小鼠的肝损伤差异。
3内质网应激直接介导的细胞凋亡和通过NLRP3炎症小体激活介导的细胞焦亡在雷公藤甲素肝损伤中的作用研究：选用成年雄性C57BL/6N小鼠，依据量毒和时毒关系研究结果，选取0.8mg/kg雷公藤甲素作用24h的肝脏切片及肝组织，采用TUNEL试剂盒及westernblot技术，检测雷公藤甲素肝损伤中细胞死亡方式；采用qPCR及westernblot技术检测肝组织引起肝细胞凋亡及焦亡有关的内质网应激和NLRP3炎症小体通路相关基因(Atf4、Ddit3、Ero1a、Gadd34、Dr5、Trailr2、Bim、Bax、Nlrp3、Pycard、Panx1及Casp1)及蛋白表达(p-Eif2α、p-IRE1α及CHOP)变化；使用内质网应激抑制剂TUDCA和Caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk，观察阻断内质网应激通路及NLRP3炎症小体通路后小鼠肝损伤情况；检测肝组织中GSH和活性氧(ROS)水平，并用C57BL/6N小鼠原代肝细胞，使用不同剂量雷公藤甲素作用，检测引起内质网应激的氧化应激相关基因(Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm6、Gstp1、Gstp2、Gstt2、Mgst1、Nrf2、Hmox1、Gclm、Sod1、Sod2、Cat、Prdx1、Txnrd2及Txnrd3)mRNA的表达情况。
结果：
1低剂量雷公藤甲素(0.2mg/kg和0.4mg/kg)对小鼠血清ALT和AST水平并无显著影响，肝组织切片均无明显肝细胞损伤。随着雷公藤甲素剂量增加，血清ALT和AST水平显著升高，肝组织切片显示肝损伤程度存在剂量相关性。给药后12h内，血清ALT和AST水平及肝组织切片均未产生明显变化；给药48h时ALT及AST水平升至最高。当雷公藤甲素的给药剂量为0.8mg/kg，作用时间为24h时，其肝损伤作用稳定且毒性程度适中。
2与wild-type小鼠组相比，RIPK3-null组小鼠血清ALT与AST水平没有明显差异，肝组织切片显示，肝损伤程度并未有所改善。提示雷公藤甲素导致的肝损伤机制与RIPK3介导的坏死性凋亡无直接关系。
3与空白对照组相比，雷公藤甲素组中执行细胞凋亡的蛋白CASP3和焦亡的蛋白CASP1(p20，p22)显著增加，并且TUNEL结果呈阳性，提示雷公藤甲素可能导致肝细胞凋亡及焦亡；介导细胞凋亡及焦亡的内质网应激和NLRP3炎症小体通路相关基因mRNA及蛋白在雷公藤甲素给药组含量均升高；采用抑制剂TUDCA和Ac-YVAD-cmk均可显著缓解雷公藤甲素肝损伤程度，提示阻断内质网应激及NLRP3炎症小体通路能够降低雷公藤甲素肝损伤；进一步研究发现，雷公藤甲素能够显著降低肝组织GSH，并升高ROS水平，并在体内外均能够抑制GSH合成酶及ROS清除酶相关基因的表达。
结论：雷公藤甲素能够消耗机体GSH并抑制GSH合成酶及ROS清除酶的合成，改变体内氧化还原内稳态，进而导致内质网应激，一方面直接介导肝细胞凋亡，另一方面通过NLRP3炎症小体通路介导肝细胞焦亡。
第二部分雷公藤甲素肝损伤的代谢组学研究
目的：建立基于UPLC-Q-TOFMS的小鼠血清及肝组织代谢组学分析方法，通过分析不同剂量下差异代谢物及代谢通路变化规律，深入探讨雷公藤甲素肝损伤作用机制。
方法：40只成年雄性C57BL/6N小鼠，随机分为5组，每组8只，即空白对照组和不同剂量雷公藤甲素组。给药24h后，处死小鼠，收集血清及肝脏。基于UPLC-Q-TOFMS技术，采用WatersAcquityBEHAmide柱(2.1mm×50mm,1.7μm)在ESI源正负离子模式下对小鼠血清及肝脏样本进行检测，对原始数据进行预处理，并通过多元统计分析，筛选差异代谢物，利用质荷比及二级图谱与在线数据库Metlin、HMDB及PubChem对比，鉴定差异代谢物，利用在线软件MetaboAnalyst4.0及在线通路数据库KEGG对潜在生物标志物进行代谢通路分析。
结果：在血清及肝组织的代谢组学研究中，原始数据通过数据处理及多元统计分析后，筛选并鉴定出77个差异化合物，包括脂类、胆碱类，脂肪酸类、核糖及核酸类等内源性小分子物质。这些差异代谢物主要涉及谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢、泛酸和辅酶A生物合成、甘油磷脂代谢、三羧酸循环、嘧啶代谢、烟酸和烟酰胺代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢及氨基酸代谢等。
结论：本研究采用非靶向代谢组学技术对不同剂量雷公藤甲素作用下小鼠血清及肝组织进行了分析，发现雷公藤甲素能够导致机体多条代谢通路发生改变，氧化应激、脂代谢及氨基酸代谢紊乱起重要作用。为雷公藤甲素肝损伤中生物标志物的最终发现及肝损伤机制的进一步研究提供了指导。
第三部分雷公藤甲素肝损伤的转录组学研究
目的：基于RNA-seq测序技术，对不同剂量雷公藤甲素作用下小鼠肝组织的基因表达谱进行检测，通过分析不同剂量下差异表达基因及毒性通路，从基因层面探讨雷公藤甲素肝损伤作用机制。
方法：40只成年雄性C57BL/6N小鼠，随机分为5组，每组8只，即空白对照组和不同剂量雷公藤甲素组。给药24h后，处死小鼠，收集肝脏。提取肝组织总RNA，进行质量检测，并纯化，采用高通量转录组学测序(RNA-seq)技术，进行mRNA测序并筛选差异表达基因，运用IPA软件对差异表达基因进行毒性作用通路及毒性功能分析，并进行深入的生物信息学分析。
结果：通过对不同剂量雷公藤甲素作用下的基因表达谱进行了检测及深入分析，分别发现133、1234、5839和7312个基因的表达显著改变，差异表达基因数目呈现明显的剂量依赖性。差异表达基因在IPA中富集的通路主要包括：AHR信号、Nrf2介导的氧化应激反应、SAPK/JNK信号、死亡受体信号、凋亡信号巨噬细胞中NO及ROS的生成、LPS/1L介导的RXR功能抑制、肝纤维化/肝星状细胞激活、IL-8信号、NK-κB信号、PPAR信号及肝脏胆汁淤积等通路。
结论：本研究采用高通量转录组学测序(RNA-seq)技术，通过对不同剂量雷公藤甲素作用下小鼠肝脏差异表达基因的毒性作用通路及功能分析，深入探讨了雷公藤甲素肝损伤作用机制。结果表明其主要与肝细胞死亡、炎症反应及代谢紊乱有关。本部分研究为雷公藤甲素肝损伤作用机制研究提供了新的研究策略。
第四部分基于多组学联合分析的雷公藤甲素肝损伤作用机制研究
目的：运用Cytoscape和IPA软件，对0.8mg/kg雷公藤甲素作用下差异代谢物和差异表达基因进行整合分析，并结合体内动物实验，对多组学分析结果进行验证，进一步探讨雷公藤甲素肝损伤作用机制。
方法：
1使用Cytoscape软件对差异代谢物及差异表达基因进行代谢网络分析；随后将差异代谢物和差异表达基因及相应的log2(Fold change)值导入IPA软件中，采用“Coreanalysis”分析功能，对相关代谢物和基因进行相关通路分析。
220只成年雄性C57BL/6N小鼠，随机分为2组，每组10只，即巨噬细胞清除组和对照组。提前分别尾静脉给予巨噬细胞清除组小鼠Clodronateliposomes；给予对照组小鼠Emptyliposomes。两天后，灌胃给予两组小鼠雷公藤甲素。给药24h后，处死小鼠，收集血清及肝脏。测定血清ALT和AST水平，HE染色法检测肝组织病理变化。
结果：
1通过对差异代谢物和差异表达基因数据进行整合分析，发现巨噬细胞中一氧化氮及活性氧的产生通路变化较为显著。
2巨噬细胞清除实验结果表明，与对照组比较，巨噬细胞清除组小鼠给予雷公藤甲素后血清ALT和AST水平未见显著升高，并且肝组织切片显示肝组织结构正常。结果表明巨噬细胞在雷公藤甲素肝损伤中具有重要作用。
结论：本研究采用Cytoscape和IPA软件初步对代谢组学数据和转录组学数据进行了整合分析，构建了差异代谢物和差异表达基因的相互作用网络图，并进行了代谢通路富集分析，推测巨噬细胞在雷公藤甲素肝损伤中具有重要作用。同时结合体内巨噬细胞清除实验，对多组学分析结果进行验证，进一步证明巨噬细胞在雷公藤甲素肝损伤中的作用。