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背景过敏性疾病是临床上的常见病、多发病。食物、花粉、毒素、昆虫都含有多种过敏原蛋白。蛇毒是一类含有多种蛋白和非蛋白物质,具有广泛的生物学活性和药理作用的天然动物毒素蛋白。目前,蛇毒来源药物的应用研究已深入到包括临床用药及临床研究在内的多个领域。做为异体蛋白,蛇毒可以成为过敏原,且引起严重过敏反应的报到屡见不鲜。目的应用双向电泳结合免疫印迹等蛋白质组学技术联合应用多维色谱-线性离子阱质谱等多种相关技术,检测和鉴定湖南烙铁头蛇毒主要过敏原蛋白组分。方法将已制备好的蛇毒蛋白质通过双向电泳(two dimensional electrophoresis,2-DE),即通过等电聚焦(IEF)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后,电转印转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,继而分别用对湖南烙铁头蛇毒过敏的患者血清和IgE阴性健康人血清作为一抗,后加入抗IgE抗体进行免疫印迹(immunoblotting),电化学发光(electrochemiluminescence, ECL)检测杂交信号。根据免疫印迹的结果,从平行实验的经考马斯亮蓝染色的凝胶上挖取与蛇毒特异性IgE相互作用的蛋白点,经“胶内酶解”后,抽提出上述酶解片段混合物进行多维液相色谱-离子阱质谱串联技术分析(]multidimensional liquid chromatography-ion trap mass spectrometry, MDLC-ESI-LTQ-MS/MS),获得每个过敏原蛋白质的肽段序列数据,确定过敏原蛋白质的身份。结果通过2-DE有83个蛋白质组分被检测出来。与传统的SDS-PAGE凝胶电泳相比,双向电泳的蛋白分离效果和分辨率明显提高,其中包括同种异体过敏原蛋白。其中大约90.00%的蛋白质的相对分子质量(Mr)分布在15～45kDa之间,大约72.29%的蛋白质等电点(pI)在4.0～7.0之间。7例病人血清免疫印迹后均有阳性点出现,与过敏患者血清IgE结合的蛋白点主要有9个。但患者之间表现为明显异相性,IgE结合的蛋白点从4个到9个不等。其分子量和等电点主要集中在30kd-40kd,5.20-7.84间。阳性血清结果中,蛋白点6,8,9与7例蛇毒蛋白过敏患者血清特异性IgE均呈阳性反应,阳性率均为100%。而阴性对照血清没有特异结合的蛋白条带出现。多维液相色谱-离子阱质谱(MDLC-ESI-LTQ-MS/MS)共鉴定出9个蛋白点分属于5类不同的蛋白,包括mucofirase3(Protobothrops mucrosquamatus), serpentokallikrein-2(Protobothrops mucrosquamatus), Plasminogen activator Haly-PA(Gloydius blomhoffi brevicaudus), H2proteinase (Trimeresurus flavoviridis), metalloproteinase PMMP-3(Protobothrops mucrosquamatus)。序列覆盖率最高的是1号点,高达66.15%；其次是2号点,65.37%,且两者同属于同种异体过敏原蛋白；最低的点为9号点,仅有9.98%。结论本研究应用双向电泳结合免疫印迹等蛋白质组学技术联合应用多维色谱-线性离子阱质谱,进行过敏原的检测和鉴定。通过对湖南烙铁头蛇毒的2-DE分析研究,获得其组分的表征特点,不仅有助于增强人们对毒素的了解,并对新药设计中的先导化合物寻找具有重要意义。鉴定了湖南烙铁头蛇毒蛋白中的致敏组分,为蛇毒药物所致过敏性疾病的诊断及治疗提供了理论依据,为后续进一步建立体内／外蛇毒过敏组分解析诊断研究奠定基础。