内脏脂肪素(visfatin)是脂肪细胞产生和分泌的一种细胞因子,并能够通过内分泌或旁分泌的方式运输到其他组织器官,参与机体的免疫、炎症反应以及调节机体的代谢平衡。在脂肪组织中,visfatin在调控脂肪代谢的过程中发挥着重要作用,然而visfatin在山羊中的相关研究未见报道,同时关于visfatin在脂肪细胞中转录调控的研究也较少。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)是调控脂肪细胞分化的关键基因,是脂肪细胞分化关键的转录因子。因此,研究PPARγ与visfatin的作用关系有助于进一步揭示PPARγ在山羊脂肪细胞代谢过程中的作用机制。本研究首先分离克隆得到山羊visfatin基因,然后通过qPCR分析其在不同组织和脂肪细胞分化过程中的表达模式。此外,利用油红O染色来观察脂肪细胞分化过程中脂滴的变化以及罗格列酮(rosiglitazone)对脂肪细胞分化的作用。进一步,分离克隆得到山羊visfatin基因启动子序列,构建了visfatin基因启动子的缺失载体,通过双荧光素酶报告基因检测系统和ChIP分析了visfat n基因的转录调控机制。主要结果如下:1.本实验克隆获得了山羊的visfatin基因,位于山羊基因组的4号染色体上,其开放阅读框(ORF)大小为1476bp,编码的氨基酸数目为491个。氨基酸序列与牛、猪、鼠的相似性分别达到了 99%、98%和98%。分析其保守结构域发现,visfatin具有典型的PBEF蛋白结构域,是PRTase-typeⅡ超家族的一员。2.组织表达分析表明:visfatin基因在肾脏中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.01),其次在脑和皮下脂肪组织表达量也相对较高,而在其他组织中表达量相对较低。3.通过油红O染色和甘油三酯的测定可知,在脂肪细胞分化的过程中,脂滴的积累和甘油三酯的含量不断增多。在分化的早期,脂滴数量较少,体积较小。随着分化的进行,脂滴逐渐增多,同时小脂滴逐渐融合,形成了体积较大的大脂滴。甘油三酯的含量从第0天到第4天相对较低,第6天到第10天显著增加(P<0.01),第10天达到峰值。此外,rosiglitazone处理促进了山羊脂肪细胞的分化,前体脂肪细胞在分化的第8天和第10天显著增加甘油三酯的含量(p<0.01)。4.通过qPCR检测山羊前体脂肪细胞分化过程中visfatin和PPARγ的表达规律及rosiglitazone处理对其表达的影响。visfatin在分化的第0天到第6天逐渐升高,第6天达到最大值后开始降低,第10天时表达量降到最低。PPARy从第0天到第4天呈现升高的趋势,在第4天时达到最大值,之后逐渐降低。Rosiglitazone对visfatin和PPARγ的表达均有显著影响。在第0天和第2天,rosiglitazone促进了 visfatin的表达,第2天达到显著差异(P<0.05);而从第4天开始对visfatin的表达具有抑制作用,第4天达到显著水平(P<0.05),在第6天和第10天时达到了极显著水平(P<0.01)。Rosiglitazone能够促进PPARy的表达,在第2天到第6天具有显著差异(P<0.01),而在其他阶段差异不显著。5.在山羊前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞中,GSK3β调控山羊PPARγ和visfatin基因的表达。和对照组相比,过表达GSK3β显著降低了 visfatin基因的表达(P<0.05),但显著增加了 PPARγ基因的表达;反之,SB216763处理后,visfatin基因的mRNA表达水平显著升高,而对PPARy的表达有显著的抑制作用(P<0.05)。6.利用双荧光素酶报告系统检测visfatin启动子活性,结果表明:-735/+34片段的启动子活性显著高于-1624/+34和-486/+34的活性。通过对visfatin基因启动子序列分析发现在-735/+34片段中包含有一个PPARγ结合的位点。将此结合位点突变后,其启动子活性显著降低(P<0.01)。同时,rosiglitazone处理后的结果表明,visfatin基因-735/+34片段的启动子活性被显著抑制(P<0.01),而PPARγ结合位点突变的启动子片段活性没有受到影响。rosiglitazone对前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞中visfatin的mRNA水平都具有显著的抑制效果(P<0.05),表明PPARγ能够抑制visfatin的表达。7.ChIP实验证明PPARy能够与visfatin的启动子结合,rosiglitazone处理使与visfatin启动子结合的PPARγ减少。和对照组相比,过表达GSK3β减少了与visfatin启动子结合的PPARy蛋白,而SB216763处理增加了 PPARy与visfatin启动子的结合。本试验结果进一步证明了 GSK3β能够通过PPARy调控visfatin的转录。