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研究背景及目的颞下颂关节紊乱病(TMD)是一类临床症状表现为颞下颁关节区疼痛、异常关节音或伴有下颂运动功能障碍的一组疾病的总称,正常人群中发病率为20%-40%,是口腔科常见病、多发病之一。其发病与生理、社会、心理因素相关,但其病因及发病机制仍未阐明。颞下颂关节骨关节炎(TMJOA)是TMD的一个重要类型,发病率约为25%,是一类主要累及颞下颂关节髁突软骨、滑膜及软骨下骨的以关节软骨和软骨下骨质改变为主要特征的器质性病变疾病。TMJOA的发生与IL-1β、TNF-α、IL-6等细胞因子及Notch等信号通路有着密切的关系。其中,IL-1可能是在众多炎性细胞因子中的一个核心因子。IL-1是一种重要的促炎细胞因子,由IL-1α与IL-1β两种蛋白质组成,可与IL-1受体结合,从而激活下游炎性通路。其作为炎症的始动因子,在软骨细胞炎症反应和细胞凋亡过程中起到关键作用。IL-1β可能通过刺激TNF-α、IL-6、ICAM-1等炎性细胞因子的分泌和抑制胶原蛋白、TIMPS等的合成来干扰关节软骨细胞代谢,促进细胞分解代谢,显著抑制软骨细胞合成基质,使软骨细胞变性及细胞外基质降解,引发关节炎症和破坏,是造成颞下颌关节器质性损害的一种重要炎性介质。Notch信号通路由受体、配体、细胞内效应分子、其他的效应物和Notch的调节分子等组成,在多种组织细胞的生长、分化、增殖、凋亡中起着重要作用。Notch信号通路对软骨形成、软骨细胞的存活、骨重建、维持关节软骨细胞表型及调节软骨基质代谢中起关键作用,其调节异常可导致骨性关节炎。Notch信号分子在健康成熟的关节软骨中几乎消失,但是在受损的软骨中却可检测到高水平的Notch信号分子表达,但是,目前仍未明确Notch信号通路在软骨病变中的作用机制。本次研究通过建立Sβraguee Dawley大鼠(SD大鼠)颞下颁关节软骨细胞的体外模型,使用IL-1β对软骨细胞进行诱导刺激,采用Notch1抑制剂(Notch1 siRNA)抑制Notch1信号通路的表达。通过实时定量RT-PCR、蛋白质印迹分析(WB)、酶联免疫吸附试验(ELISA)对软骨细胞Notch1蛋白及mRNA、ICAM-1蛋白及 mRNA、iNOS 蛋白及 mRNA、NICD、MMP-1、MMP-9、TIMP-1、磷酸化NF-κB 65及细胞核、细胞质中NF-κB p65蛋白的表达和软骨细胞TNF-α、IL-6的分泌水平进行检测。讨论分析Notch1信号通路在IL-1β诱导的颞下颂关节软骨细胞的炎症反应中的作用,为TMD/TMJ OA的临床治疗提供新的研究思路。材料与方法本实验采用从SD大鼠颞下颌关节分离提取的髁突软骨细胞,进行细胞培养、传代,并根据施加不同干扰因子及检测指标将实验分成5部分:1.实验一实验细胞分为空白对照组、PBS组(阴性对照组)、IL-1β刺激组,通过实时定量RT-PCR、WB分别检测软骨细胞Notch1 mRNA、Notch1蛋白、NICD蛋白的表达;2.实验二实验细胞分为空白对照组、Notch1 siRNA组、Notch1 Si-NC组(阴性对照组),通过实时定量RT-PCR、WB分别检测软骨细胞Notch1 mRNA、Notch1蛋白的表达;3.实验三实验细胞分为空白对照组、IL-1β刺激组、Notch1 siRNA+IL-1β组、Notch1 Si-NC+IL-1β组(阴性对照组),通过ELISA检测软骨细胞分泌的TNF-α和IL-6,通过实时定量RT-PCR检测、WB分别检测软骨细胞ICAM-1 mRNA、iNOS mRNA和ICAM-1蛋白、iNOS蛋白的表达;4.实验四实验细胞分为空白对照组、IL-1β刺激组、Notch1 siRNA+IL-1β组,通过WB检测软骨细胞MMP-1、MMP-9、TIMP-1;5.实验五实验细胞分为空白对照组、IL-1β刺激组、Notch1 siRNA+IL-1β组,通过WB检测软骨细胞磷酸化NF-κB p65及细胞核、细胞质中NF-κB p65蛋白的表达。研究结果1.IL-1β上调了软骨细胞Notch1与NICD的表达;2.Notch1 siRNA可降低软骨细胞Notch1的mRNA及蛋白表达;3.抑制Notch1信号通路可降低IL-1β诱导的软骨细胞TNF-α,IL-6的分泌水平和ICAM-1、iNOS的mRNA及蛋白表达水平;4.抑制Notch1信号通路可减轻IL-1β诱导的软骨细胞MMPs与TIMP-1的表达失衡;5.抑制Notch1信号通路可抑制IL-1β诱导的软骨细胞NF-κB 65核易位及磷酸化。结论及意义IL-1β可诱导SD大鼠颞下颌关节软骨细胞Notch1、NF-κB信号通路的激活表达,引起软骨细胞的炎症反应及细胞外基质降解。Notch1 siRNA可抑制软骨细胞Notch1信号通路的激活表达,部分抑制IL-1β诱导的软骨细胞NF-κB信号通路的激活表达。抑制Notch1信号通路可减轻IL-1β诱导的大鼠颞下颌关节软骨细胞的炎症反应程度,为临床治疗TMJ OA提供一定的理论依据。