研究背景与目的:脓毒症是感染所致的一种临床综合征,主要表现为因宿主免疫应答失调引发的多器官功能紊乱。脓毒症是临床危重症病人死亡的首要因素之一,但目前尚无可靠有效的防治药物用于临床治疗。业已证实,机体内过度的炎症反应是导致脓毒症发病和多器官功能紊乱的核心病理事件。因此,对炎症反应的关键环节进行拮抗是脓毒症药物研发的重要方向。炎症小体是近年来发现的新型炎症调控平台,在机体炎症发生中发挥关键调节作用,其中NLRP3炎症小体是目前研究最为广泛的炎症小体类型。近来发现,NLRP3的活化与脓毒症的发生发展关系密切。研究显示多种诱发脓毒症的重要病原体分子模式(PAMPs)都可在机内体激活NLRP3炎症小体,介导IL-1家族炎症因子成熟释放并导致免疫细胞焦亡等的发生,因此它的过度活化在脓毒症的发生发展中起重要作用。NLRP3炎症小体的活化过程包括蛋白组分转录表达和蛋白复合物装配。PAMPs激活模式识别受体(PRRs)下游胞内信号转导途径启动蛋白组分的转录表达,又被称为第一信号(signal 1),如LPS。LPS被细胞TLR4识别后激活NF-κB和MAPK信号通路启动炎症因子前体和NLRP3转录表达。其他激活因子启动蛋白复合物装配,被称为是第二信号(signal 2),如ATP。第二信号调控NLRP3炎症小体复合物装配的具体分子机制尚不清楚,但近来钾离子外流模型得到更多的认可,ATP促进胞内钾离子外流介导NLRP3、ASC和caspase-1组装成蛋白嵌合体,激活炎症小体下游效应。氯喹最早作为抗疟疾药物广泛应用于临床,近年来在类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等自身免疫疾病中也有应用。我们课题组最先报道了氯喹对脓毒症模型小鼠的保护作用,且发现该作用与其介导的TLR4通路的抗炎效应密切相关。在后续研究中,我们还发现氯喹通过影响蛋白泛素化系统抑制其炎症效应,提示氯喹可能存在多重的抗炎机制。氯喹对脓毒症模型小鼠的保护作用是否与NLRP3炎症小体活化有关,具体分子机制是与signal1还是signal2有关,目前均不清楚,也无相关文献报道。因此,本课题首先在脓毒症动物模型中展开氯喹对NLRP3活化的效应研究。进而在体外建立巨噬细胞NLRP3炎症小体激活模型,从转录起始和装配调控层面研究其调控NLRP3炎症小体活化的分子机制。最终明确氯喹调控NLRP3炎症小体活化的作用和分子机制,为扩大氯喹的适应症提供实验依据,也为基于炎症小体抑制作用的抗脓毒症药物研究提供新思路。方法:1.氯喹体内抑制NLRP3炎症小体活化及其介导脓毒症模型小鼠保护效应的作用研究1.1通过对BABL/c小鼠尾静脉注射内毒素建立死亡率高于70%的脓毒症动物模型。腹腔给药的方式给予30mg/kg或10mg/kg剂量的氯喹,观察记录模型小鼠的7天生存情况。分别在LPS攻击6h和24h后采集小鼠外周血,检测血液中ALT和AST水平;在相同时相点获取小鼠肝、脾、肺等组织进行HE染色观察药物对LPS介导的脏器损伤的影响,明确药物对模型动物的保护作用。1.2在1.1建立的模型动物基础上,给药30mg/kg剂量的氯喹,分别于LPS攻击后6h、12h和24h采集小鼠外周血和腹腔灌洗液。ELISA检测外周血中IL-1β和IL-18释放水平。同时获取小鼠肝、脾和肺等组织进行组织匀浆,检测匀浆液中IL-1β和IL-18蛋白水平,capase-1活化水平和NLRP3蛋白表达水平,明确氯喹对NLRP3炎症小体活化及其下游效应的作用。2.氯喹抑制NLRP3炎症小体活化的作用机制研究2.1体外分离诱导骨髓源巨噬细胞(BMDMs),激光共聚焦和流式细胞仪检测F4/80阳性细胞率;通过LPS和ATP刺激建立体外LPS介导的NLRP3炎症小体激活细胞模型;不同剂量氯喹处理细胞后检测细胞上清中IL-1β和IL-18释放水平;蛋白免疫印迹法(WB)检测药物作用后细胞裂解液和细胞上清中的ASC、caspase-1前体和caspase-1 p10表达水平;不同ATP作用时相点药物影响细胞LDH释放率;检测药物抑制其它NLRP3炎症小体激活因子促进IL-1β释放的影响;在腹腔巨噬细胞系中观察药物对IL-1β释放的影响;明确氯喹对LPS和ATP介导的巨噬细胞NLRP3炎症小体活化的作用。2.2 ELISA检测氯喹对细胞内IL-1β和IL-18前体表达水平和细胞上清中的成熟释放水平的影响;RT-q PCR检测氯喹影响LPS介导的IL-1β和IL-18的转录水平;进一步检测氯喹对NLRP3基因转录水平和蛋白表达水平的影响;明确氯喹对NLRP3炎症小体活化信号一通路的作用。WB检测氯喹影响LPS介导的NF-κB p65磷酸化水平、IκBα磷酸化水平和IκBα总蛋白降解降解水平;激光共聚焦观察NF-κB p65核转位情况;WB检测氯喹影响MAPK通路中ERK、P38和JNK的激活水平;明确氯喹作用于炎症小体蛋白组分转录从而调控NLRP3炎症小体活化的分子机制。2.3改变氯喹作用阶段或洗涤细胞去除药物后检测IL-1β释放变化;激光共聚焦观察免疫荧光标记的ASC蛋白在胞内形成ASC specks,计算ASC specks阳性细胞百分率;不同浓度钾离子影响氯喹抑制IL-1β释放,检测氯喹影响胞内钾离子浓度,比较氯喹对钾离子外流效应的影响,明确氯喹通过影响蛋白复合物装配调控NLRP3炎症小体活化。Affymetrix基因表达谱芯片检测氯喹影响LPS介导的巨噬细胞活化的差异表达基因;GO富集分析钾离子代谢相关的差异表达基因;RT-q PCR和WB检测氯喹影响ATP1B3的基因表达水平和蛋白表达水平;WB检测si ATP1B3-1、si ATP1B3-2、si ATP1B3-3干扰后ATP1B3蛋白表达水平,确认si RNA对ATP1B3蛋白表达干扰作用;si ATP1B3后对LPS和ATP激活的NLRP3炎症小体的下游效应的影响;检测si ATP1B3后细胞IL-1β释放、caspase-1激活水平,确认氯喹通过ATP1B3影响NLRP3炎症小体活化的作用。结果:1.氯喹体内抑制NLRP3炎症小体活化及其介导脓毒症模型小鼠保护效应的作用研究1.1模型组小鼠7天生存率低于30%,30mg/kg氯喹显著提高模型组小鼠生存率(p=0.0155);模型组小鼠肺组织出现可见弥漫性出血、水肿,伴有散在炎细胞侵润,氯喹明显减轻该效应;氯喹显著抑制模型动物体内升高的血清ALT和AST;表明氯喹减轻模型动物器官损伤,提高脓毒症模型小鼠生存率。1.2血清学检测结果显示,模型组在6h、12h和24h的IL-1β和IL-18显著高于生理盐水对照组,氯喹显著抑制IL-1β和IL-18释放;同时,在腹腔灌洗液中检测到与血清学相似效应;在肝脏和肺组织中均检测到模型组小鼠IL-1β和IL-18水平显著上调,氯喹对该上调效应有显著抑制作用;WB检测结果显示氯喹显著抑制LPS攻击引起的caspase-1激活;同时,在组织中还发现氯喹抑制模型组的NLRP3蛋白表达水平上调。表明氯喹抑制体内NLRP3炎症小体激活及其下游效应。2.氯喹抑制NLRP3炎症小体活化的作用机制研究2.1体外分离诱导获得纯度较高的BMDMs中,氯喹剂量-效应依赖性抑制LPS和ATP介导的巨噬细胞IL-1β和IL-18释放;WB检测结果显示LPS和ATP激活caspase-1p10生成,氯喹显著抑制该作用且不影响caspase-1前体和ASC蛋白表达;LPS和ATP介导细胞LDH快速释放,氯喹显著抑制该效应;氯喹能够抑制nigericin介导的IL-1β成熟释放;在腹腔巨噬细胞中也观察氯喹具有相似的作用,表明氯喹下调巨噬细胞NLRP3炎症小体活化,减少IL-1β和IL-18成熟释放,抑制细胞焦亡。2.2细胞内蛋白水平检测结果提示氯喹抑制IL-1β和IL-18前体表达水平,通过RT-q PCR检测确定氯喹通过抑制IL-1β和IL-18转录降低前体的表达;同时氯喹通过抑制Nlrp3转录水平降低NLRP3表达。LPS上调NF-κB p65(ser536)和IκBα蛋白磷酸化水平,促进IκBα蛋白降解,从而激活巨噬细胞内NF-κB信号通路,氯喹对NF-κB信号通路具有抑制效应;LPS明显增强NF-κB p65核转位效应,氯喹明显抑制NF-κB p65核转位水平;另外氯喹抑制MAPK信号通路的ERK、JNK和p38的磷酸化激活水平。上述结果表明氯喹通过抑制NF-κB和MAPK信号通路抑制NLRP3蛋白组分的转录水平,从而负调控NLRP3炎症小体活化。2.3细胞外IL-1β和IL-18水平检测结果提示氯喹显著IL-1β和IL-18的剪切成熟;在不同激活阶段、细胞洗涤去除药物作用后检测IL-1β释放水平,结果显示氯喹对NLRP3炎症小体激活相关的转录启动和蛋白装配信号通路都有抑制作用;高浓度的钾离子显著增强氯喹的抑制效应;相较于LPS+ATP组,氯喹胞内钾离子浓度显著升高,提示氯喹显著抑制钾离子外流;表明氯喹同时抑制signal 2信号活化的NLRP3炎症小体。Affymetrix表达谱芯片结果中的钾离子代谢相关差异表达基因进行GO富集结果显示,氯喹上调ATP1B3基因表达水平;进一步验证发现氯喹相较于LPS组显著上调ATP1B3的m RNA水平和蛋白表达水平;si RNA有效干扰细胞内ATP1B3蛋白表达后,显著上调LPS和ATP介导的NLRP3炎症小体激活的下游效应;ATP1B3表达被干扰后,氯喹对NLRP3炎症小体活化的抑制效应显著减弱。表明氯喹上调ATP1B3,抑制钾离子外流,进而抑制NLRP3炎症小体的装配。结论:1.氯喹体内能够抑制NLRP3炎症小体活化,降低IL-1家族炎症因子成熟,进而发挥对脓毒症模型小鼠的保护作用。2.氯喹在体外抑制LPS和ATP介导的巨噬细胞NLRP3炎症小体激活,减少IL-1β和IL-18的成熟释放,抑制细胞焦亡的发生。3.氯喹通过抑制炎症小体蛋白组分的转录起始和复合物装配两个信号通路负调控NLRP3炎症小体活化。氯喹通过MAPK和NF-k B信号通路抑制NLRP3炎症小体相关蛋白转录表达。氯喹还可上调ATP1B3的表达,抑制钾离子外流,从而负调控NLRP3炎症小体复合物装配。