研究背景脑缺血是60岁以上最常见第二大死亡因素、第二大痴呆病因,并且在高收入国家中,中风占到医疗健康预算的3%-7%。随着我国老年化人口不断增加,近年来脑缺血的患病人数在持续递增,脑缺血成为我国最重要的公共卫生问题之一。长期以来,人们一直认为只要及时恢复供血,就能将缺血引发的损伤降到最低。然而这一理论在20世纪70年代受到质疑。有研究认为,对缺氧组织突然恢复供氧,会导致一种独特的损伤反应产生,并且不同于低氧状态下的损伤反应。因此,缺血再灌注损伤被发现,迅速发展成为一个新的研究领域。脑缺血再灌注损伤是指脑组织缺血、缺氧一定时间后造成了组织损伤,但积极治疗恢复脑部血供后,脑损伤程度非但没减轻反而加重,出现了更为严重的脑功能障碍,甚至引起多器官损伤的现象。但目前对脑缺血的治疗,临床共识依然是尽快恢复供血,减轻脑组织缺血程度。因此,再灌注损伤无法避免,而对于减少再灌注损伤的治疗,临床上缺少有效的治疗药物。所以研究减少再灌注损伤的治疗具有重要临床意义。黄芪甲苷是一种从黄芪上提取出来的单体。现代药理学研究发现,黄芪具有多种药用价值,如抗炎、免疫调节、抗氧化、抗癌、抗糖尿病、心肌保护、保肝、抗病毒功能等。研究显示,黄芪甲苷具有很好的脑保护作用,能通过抑制缺血后半暗带区的外周型苯二氮卓受体的表达,减少半暗带区面积,保护脑组织。还能显著改善双侧颈总动脉闭塞小鼠的记忆障碍和神经炎症,机制是降低TLR4及其下游受体蛋白的表达,包括MyD88、TRIF和TRAF6,并且抑制NF-κB的磷酸化。还有一些研究表明,黄芪甲苷对缺血再灌注大脑的保护,是由于能改善血脑屏障的功能,降低血脑屏障在病理状态下的通透性。在本实验中,我们发现黄芪甲苷能通过抑制内质网应激和减少线粒体损伤,减少脑血管内皮细胞的凋亡,从而保护血脑屏障的结构和功能,达到保护脑组织和减少梗死面积的作用。实验一:黄芪甲苷对MCAO大鼠的血脑屏障的预保护作用研究目的:研究黄芪甲苷在大脑缺血再灌注后对血脑屏障的预保护作用,并测定内质网应激相关蛋白,以确定其机制。方法:SPF级SD雄性大鼠140只,年龄在6周左右。随机将大鼠分为5个组。采取的给药方式为造模前灌胃给药3周。用线栓法造大鼠脑缺血再灌注模型,缺血2h,再灌注24h。再灌注结束后,检测TTC、伊文氏蓝、HE染色、尼氏染色、SOD、MDA、蛋白电泳检测相关蛋白。结果:1.神经功能缺损评分采用Longa’ s的5级标准评分法评分,除sham组外,其余四组动物评分无明显差异。2.TTC染色实验vehicle组大鼠的梗死面积明显多于其他几组(sham组:p=0.002,其他几组:p<0.05),且三个用药组梗死面积均明显少于vehicle组差异有明显的统计学意义(ASL:p=0.018;ASM:p=0.006;ASH:p=0.003)。3.伊文氏蓝染色实验直接显微镜镜下观察,vehicle组大鼠右侧大脑较其他组颜色更深。vehicle组大鼠梗死侧大脑中伊文氏蓝的含量,显著高于假手术组(P<0.001)和用药组(ASL:p=0.010;ASM:p=0.001;ASH:p<0.001)。比较左侧大脑,这5个组伊文氏蓝含量没有统计学差异(P>0.05)。4.HE染色结果sham组显示脑组织皮质结构正常,细胞完整,胞浆丰富,核仁清晰。而vehicle组和用药组大鼠梗死侧皮质HE染色结果显示,梗死侧大脑皮质出现经典梗死病理改变(梗死区域可见固缩坏死神经元,细胞数量少,呈嗜伊红染色)。而各用药组与vehicle组比较,细胞损伤减轻,嗜伊红染色也相对减少。5.尼氏染色结果sham组显示大脑皮质尼氏小体排列整齐,数量多。而vehicle组大鼠的梗死侧皮质尼氏小体排列稀疏,数目明显减少。与vehicle组相比,各用药组梗死侧皮质尼氏小体损伤较轻,排列较整齐,数量较多。6.黄芪甲苷对梗死侧大脑SOD与MDA的影响vehicle组大鼠右侧大脑的SOD水平明显减少(p<0.001),MDA的水平却显著提高(p<0.001)。AS能提高大鼠大脑缺血再灌注损伤区域的SOD活性(ASL:p=0.040;ASM:p=0.014;ASH:p=0.001),并降低 MDA 的水平(ASL:p=0.001;ASM:p=0.001;ASH:p<0.001)。7.黄芪甲苷对血液中SOD与MDA的影响AS低中高各组与vehicle组相比较,血中MDA水平差异无统计学意义(ASL p=0.909,ASM p=0.924,ASH p=0.902)。vehicle 组大鼠血液中的 SOD 活力比 sham组低(P=0.008)。各用药组中,只有AS 1OuM组血液中SOD活力比vehicle组高(p=0.041)。其余两组与vehicle组相比,差异无统计学意义(ASL p=0.253,ASM p=0.065)。8.黄芪甲苷对内质网应激相关蛋白的影响vehicle组大鼠脑血管内皮细胞内产生较高水平的内质网应激(BIP:p=0.001;CHOP:p=0.025;P-PERK/PERK:p<0.001;P-eif2αt/eif2α:p=0.003)。AS 能抑制BIP、CHOP、P-PERK和P-eif2α蛋白的表达,与vehicle组大鼠相比,差异有明显的统计学意义(BIP:ASL p=0.038,ASM p=0.015,ASH p=0.014;CHOP:ASL p=0.029,ASMp=0.019,ASHp=0.007;P-PERK/PERK:ASLp=0.039,ASMp=0.028,ASHp=0.004;P-eif2α/eif2α:ASL p=0.039,ASM p=0.026,ASH p=0.006)。9.黄芪甲苷的抗细胞凋亡作用vehicle组脑血管内皮细胞内产生较高水平的Bax蛋白表达,Bcl-2蛋白表达受到抑制(p<0.001)。AS能明显改善缺血再灌注大脑的内皮细胞凋亡,与vehicle组大鼠相比,差异有明显的统计学意义(ASL p=0.047,ASM p=0.037,ASH p=0.002)。vehicle组脑血管内皮细胞内产生较高水平的caspase-3蛋白表达(p<0.001)。AS能明显减少缺血再灌注大脑的内皮细胞caspase-3蛋白表达,与vehicle组大鼠相比,差异有明显的统计学意义(ASL p=0.045,ASM p=0.031,ASH p=0.011)。实验二:黄芪甲苷对缺糖缺氧再复糖复氧模型(OGD/R)内皮细胞的预保护作用研究目的:研究黄芪甲苷抑制内质网应激和减少线粒体损伤对缺糖缺氧再复糖复氧模型内皮细胞的预保护作用。方法:小鼠脑微血管内皮细胞BMECs,分为CON组、OGD/R组、OGD/R+AS 2.5uM组、OGD/R+AS 5uM组、OGD/R+AS 10uM组。待造模结束后,检测MTT、SOD、MDA、蛋白电泳检测相关蛋白、ATP、JC-1。结果:1.黄芪甲苷对正常内皮细胞以及OGD/R诱导的内皮细胞损伤的影响采用MTT法检测,黄芪甲苷对正常内皮细胞未显示毒性。在AS预保护24h后,缺糖缺氧4h再复糖复氧4h,结果显示,AS 2.5 uM(p=0.044)和5 uM(p=0.008)以及10 uM(p=0.002)对内皮细胞具有良好的预保护作用,其中10uM浓度药效最稳定。2.黄芪甲苷对OGD/R诱导的内皮细胞内SOD活性和MDA水平的影响OGD/R组与CON组相比,MDA水平较高,SOD活性下降,差异有显著的统计学意义(p=0.002)。AS能降低MDA水平,增加SOD的活力。但在降低MDA水平方面只有OGD/R+AS 5uM组和OGD/R+AS 10uM组显示出统计学上的差异(AS 5 p=0.019,AS 10 p=0.011);且在增加SOD活力方面,只有OGD/R+AS 10uM组显示出统计学上的差异(AS 10 p=0.01)。3黄芪甲苷对凋亡相关蛋白表达的影响OGD/R组与CON组相比,Bcl-2蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调,差异有显著的统计学意义(p=0.005)。AS能明显增加Bcl-2蛋白的表达,减少Bax蛋白表达(AS 2.5 p=0.047,AS 5 p=0.019,AS 10 p=0.011)。OGD/R组与CON组相比,caspase-3蛋白表达上调,差异有显著的统计学意义(p=0.003)。AS 能明显减少 caspase-3 蛋白表达(AS 2.5 p=0.034,AS 5 p=0.015,AS 10 p=0.012)。AS能起到明显的抗凋亡作用。4黄芪甲苷对内质网应激相关蛋白表达的影响OGD/R组与CON组相比,BIP、CHOP、P-PERK和P-eif2 α蛋白的表达均较高(BIP:p=0.006;CHOP:p=0.008;P-PERK/PERK:p=0.028;P-eif2α/eif2α:p=0.003)。AS能明显缓解内皮细胞内的内质网应激(BIP:AS 2.5 p=0.039,AS 5 p=0.012,AS 10 p=0.012;CHOP:AS 2.5 p=0.039,AS 5 p=0.032,AS 10 p=0.027;P-PERK/PERK:AS 2.5 p=0.048,AS5p=0.015,AS10p=0.008;P-eif2 α/eif2 α:AS 2.5 p=0.033,AS 5 p=0.009,AS 10 p=0.005)5黄芪甲苷内皮细胞的ATP影响OGD/R组与CON组相比,ATP含量明显减少(p<0.001)。AS 1OuM组能明显提高ATP的含量(p=0.005)。而AS 2.5uM和AS 5uM组与OGD/R组相比,有趋势但没有统计学上的差异(p=0.610;p=0.218)。6黄芪甲苷对线粒体膜电位的影响通过荧光倒置显微镜观察,OGD/R组与CON组相比,绿色荧光明显增多,说明MMP下降明显。AS 2.5uM、AS 5uM组和AS 10uM组,与OGD/R组相比较,红色荧光较多,说明AS能显著提高线粒体MMP的水平,改善线粒体功能。通过流式细胞术进行定量分析,OGD/R组与CON组相比,MMP水平明显下降(p<0.001)。AS 10uM组能明显缓解MMP的下降,改善线粒体功能(p=0.002)。而AS 2.5uM和AS 5uM组与OGD/R组相比,有趋势但没有统计学上的差异(p=0.148;p=0.09)结论:(1)黄芪甲苷能上调Bcl-2的表达,并下调Bax和caspase-3的表达,有效减少缺血再灌注导致的内皮细胞凋亡。(2)黄芪甲苷能下调BIP、CHOP、P-PERK和P-eif2α蛋白的表达,抑制内质网应激。(3)黄芪甲苷能增加ATP的含量,提高线粒体膜电位,有效的减少缺血再灌注对线粒体的损伤。(4)黄芪甲苷能有效的保护血脑屏障,减少脑梗死的面积,达到保护大脑神经的作用。(5)黄芪甲苷能通过有效减少线粒体的损伤,并抑制内质网应激,达到脑保护作用,但线粒体损伤与内质网应激的相互关系,有待进一步实验研究。