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研究背景糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最严重微血管的并发症之一,是全世界终末期肾病的主要病因。我国糖尿病的患病人数不断攀升,如何防治DN的发生发展是目前亟需解决的问题。足细胞是肾小球固有细胞之一,它附着于肾小球基底膜(Glomerular basement membrane,GBM)的外侧,连同GBM和毛细血管内皮细胞一起,构成肾小球血液滤过的最后屏障,涉及此屏障的任何改变都可导致蛋白尿的发生。近年来的研究发现足细胞损伤引起的滤过膜通透性改变可能是导致DN发生并持续进展至终末期肾衰最主要的原因,已经成为控制DN发生发展研究中的热点。自噬和凋亡是足细胞最重要的两个病理生理过程。生理状态下足细胞组成性的高水平自噬对细胞稳态具有重要意义,自噬障碍可导致足细胞损伤、细胞丢失并最终导致肾小球硬化。糖尿病肾病是最常见的足细胞病,足细胞自噬抑制是否导致了DN的进展,目前尚无相关研究。维生素D是一种类固醇激素,其经典作用是调节钙磷代谢。近年来发现维生素D内分泌系统存在广泛的生理功能,除了其经典的钙磷代谢之外,还包括调节肾脏和心血管功能以及免疫调节等。一系列的临床和动物研究显示,维生素D及其类似物可减少蛋白尿以及延缓糖尿病肾病的进展。但活性维生素D发挥其肾脏保护作用的确切机制尚未完全阐明。研究目的本研究旨在从体外细胞实验探讨活性维生素D是否能通过活化自噬,改善高糖诱导的足细胞凋亡,缓解足细胞损伤,从而发挥肾脏保护作用。研究方法第一部分:观察活性维生素D对高糖作用下足细胞凋亡的影响:(1)体外培养永生化小鼠足细胞,用高糖(30m M)培养0、3、6、12、24、36、48h后,采用Western blot检测Bax、Cleaved caspase-3的表达,流式细胞仪检测足细胞的凋亡率。(2)1α,25(OH)2D3(1、10、100n M)和高糖(30m M)共培养足细胞48h,分对照组(NG)、高渗组(MA,5.6m M葡萄糖+24.4m M甘露醇)、高糖组(HG,30m M葡萄糖)、高糖+1n M 1α,25(OH)2D3(HG+1 VD)、高糖+10n M 1α,25(OH)2D3(HG+10 VD)、高糖+100n M 1α,25(OH)2D3(HG+100 VD),Western blot检测Bax、Cleaved caspase-3的表达,流式细胞仪检测足细胞的凋亡率。第二部分:观察活性维生素D对高糖作用下足细胞自噬的影响:(1)体外培养永生化小鼠足细胞,用高糖(30m M)培养0、3、6、12、24、36、48h后,采用Western blot检测LC3-Ⅱ、beclin-1、Vps34的表达,激光共聚焦观察synatopodin、LC3的表达变化。(2)1α,25(OH)2D3(1、10、100n M)和高糖(30m M)共培养足细胞48h,分对照组(NG)、高渗组(MA,5.6m M葡萄糖+24.4m M甘露醇)、高糖组(HG,30m M葡萄糖)、高糖+1n M 1α,25(OH)2D3(HG+1 VD)、高糖+10n M 1α,25(OH)2D3(HG+10 VD)、高糖+100n M 1α,25(OH)2D3(HG+100VD),激光共聚焦观察synatopodin、LC3-Ⅱ的表达变化;透射电镜下观察足细胞内自噬小体的形成;Western blot及RT-q PCR半定量检测LC3-Ⅱ、beclin-1、Vps34的表达。第三部分:探讨自噬和凋亡信号的相互作用及对高糖诱导的足细胞损伤的影响:体外培养永生化小鼠足细胞,用自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)作用2h后予高糖及1α,25(OH)2D3干预,分对照组(NG)、高糖组(HG,30m M)、高糖+3-MA组(HG+3-MA)、高糖+100n M 1α,25(OH)2D3(HG+100 VD)、高糖+100n M 1α,25(OH)2D3+3-MA(HG+100 VD+3-MA),Western blot检测nephrin、podocin、LC3-Ⅱ、beclin-1、Vps34、Bax and Cleaved caspase-3的表达变化。研究结果第一部分:细胞经高糖处理后Bax、Cleaved caspase-3的蛋白水平呈时间依赖性增高;细胞凋亡率呈时间依赖性增高。加入活性维生素D后Bax、Cleaved caspase-3的表达明显降低,细胞凋亡率降低,且呈浓度依赖性。第二部分:细胞经高糖处理后LC3-Ⅱ、beclin-1和Vps 34的蛋白水平升高,24h达高峰,随后表达逐渐降低,48h明显降低。加入活性维生素D后LC3-Ⅱ、Beclin-1和Vps34的表达呈浓度依赖性升高,LC3(红色荧光)呈团块状分布增多,自噬小体的数量增多。第三部分:加入3-MA抑制自噬后nephrin、podocin、LC3-Ⅱ、Beclin-1、Vps34的蛋白表达水平下调,Bax、Cleaved caspase-3的蛋白表达水平上调。研究结论足细胞在高糖刺激下早期自噬活性增强,长期刺激自噬抑制,凋亡增加;1α,25(OH)2D3可能是一种自噬的活化剂,通过调控自噬相关蛋白beclin-1、Vps34的水平促进自噬小体的形成,改善高糖诱导的细胞凋亡,缓解足细胞损伤,从而发挥肾脏保护作用。