论文部分内容阅读
环状RNA(circular RNA,circRNA)是继miRNA和lncRNA之后新发现的一种新型非编码RNA分子,在哺乳动物细胞中具有多样性,且广泛地分布,circRNA没有自由的5’端和3’端,首尾相接形成闭合的环状结构。根据circRNA的序列在基因组DNA中的位置,circRNA被分为三大类:外显子circRNA、内含子circRNA和外显子内含子circRNA。目前的研究发现,circRNA的功能主要有以下几种:miRNA的海绵作用,与蛋白质互作,合成新的多肽,形成融合circRNA,以及调节基因转录水平和剪接过程等。已有研究表明,circRNA与多种肿瘤、动脉粥样硬化等许多人类疾病都密切相关,而大鼠肝再生中有关circRNA的研究目前还尚未发现。本课题首先以大鼠肝再生早期0h、2h和6h三个时间点为实验材料,通过RNA高通量测序技术检测三个时间点circRNA的种类及表达变化,结果表明在大鼠肝再生早期阶段有159种差异表达的circRNA,对应116种来源基因;通过两种方法从中筛选出可能发挥关键作用的circRNA,并通过qRT-PCR技术验证其在大鼠肝再生过程中的表达情况,最终有6个circRNA被挑选出来可能在大鼠肝再生早期发挥关键作用;为进一步研究circRNA在大鼠肝再生中的调节机制,circ137被挑选出做深入的机理研究;本文主要采用过表达或干涉内源性circRNA分子的方式,使用MTT、流式细胞数、qRT-PCR和Western blot等技术检测干预BRL-3A细胞中circ137的表达量对其细胞活力、周期和增殖等造成的影响,结果表明,由于circ137在BRL-3A细胞中本身含量较高,因此慢病毒包装法过表达circ137没有效果;然后又通过转染干涉片段的方法降低内源性circ137表达量,结果表明,与对照相比,自转染干涉片段后48h,BRL-3A细胞的活性降低,细胞分布在S期和G2/M期的比例显著降低,而分布在G1期的比例增加,CCNA2和CCND1等的表达量也明显降低,说明细胞周期受到阻滞;同时MYC和JUN等细胞增殖相关基因表达水平也明显降低,而凋亡相关基因CASP3和CASP9等表达水平显著增加,说明circ137表达量降低后,抑制了细胞增殖。综上,circ137可促进BRL-3A细胞的增殖。为了进一步探究circ137促进BRL-3A细胞增殖的分子机理,本课题又做了初步的探究;circ137是外显子型circRNA,且预测其有mi R-16-5p的结合位点,已有报道证明miR-16-5p参与调节肝再生过程,因此我们做出科学假设,circ137主要是通过与mi R-16-5p互作调节BRL-3A细胞的增殖作用。我们又通过一系列方法证明与circ137互作的miRNA。首先,结合公司预测、查阅文献和qRT-PCR检测,筛选出可能与circ137结合的miRNA,然后,通过RNA pulldown实验进一步检测,结果表明,在BRL-3A细胞中,circ137表达量降低时,mi R-16-5p和miR-100-5p的表达量降升高;而RNA pulldown实验证实circ137和miR-100-5p、mi R-16-5p可能存在互作关系,因此,可初步推测,circ137可与mi R-100-5p和miR-16-5p发生互作。综述所述,circ137有促进细胞增殖的作用,circ137可能是通过与miR-100-5p和mi R-16-5p互作,抑制miR-100-5p和miR-16-5p发挥其功能,进而促进BRL-3A细胞的增殖。