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目的:包括早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)在内的视网膜缺血性疾病是不同年龄阶段人群视力障碍的主要原因,其共同病理特点为视网膜新生血管(retinal neovascularization,RNV)形成。充分了解RNV形成机制对ROP和增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)等疾病的防控和诊疗至关重要。氧诱导视网膜病变(Oxygen-induced retinopathy,OIR)动物模型可较好模拟ROP患者视网膜新生血管的两阶段。我们运用定量蛋白质组学技术SWATH-MS方法,分析OIR模型小鼠视网膜蛋白的差异表达情况,探寻RNV可能的形成机制;同时采用缺氧诱导体外培养的人视网膜微血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cells,hRMECs),验证OIR模型中目标蛋白在细胞模型中的表达情况,进一步明确其在缺氧的血管内皮细胞中所发挥的作用,为探索其在缺血缺氧性视网膜疾病的诊断、治疗和预后中的作用奠定基础。方法:1.构建和鉴定OIR小鼠模型构建OIR小鼠模型。将C57BL/6小鼠从PN7至PN12置于75%氧浓度环境中饲养,PN12至PN17置于常氧环境中饲养,分别在PN12和PN17对对照组和OIR模型组小鼠行视网膜铺片和免疫荧光染色分析视网膜血管分布、无灌注区面积和RNV面积的差异情况;同时采用冰冻切片免疫荧光染色技术探究OIR模型组视网膜不同区域和不同层血管的分布情况。2.利用蛋白质组学分析对照组小鼠和OIR模型组小鼠视网膜的差异蛋白分别提取PN12和PN17时对照组和OIR模型组小鼠视网膜,采用SWATH-MS方法检测两组之间差异表达的蛋白,对差异蛋白进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和KEGG通路富集分析。根据差异蛋白的功能和表达部位进一步筛选目的蛋白,通过STRING数据库分析蛋白-蛋白间相互作用关系。qRT-PCR验证对照组和OIR模型组小鼠视网膜目的蛋白所对应基因的表达水平。3.在hRMECs相对缺氧细胞模型中验证差异蛋白的表达情况首先通过细胞免疫荧光染色和RT-PCR实验验证hRMECs,将体外培养的hRMECs分为4组:高氧组、高氧对照组、相对缺氧组和相对缺氧对照组,通过CCK-8细胞增殖实验验证高氧和相对缺氧对hRMECs增殖能力的作用,通过qPCR检测细胞模型中VEGF基因的表达水平。提取hRMECs细胞RNA,RT-PCR实验筛选细胞中高水平表达的目标蛋白对应基因,并在高氧和相对缺氧细胞模型中检测目标基因的表达水平。结果:1.OIR模型动物RNV形成对照组和OIR模型小鼠视网膜铺片免疫荧光染色结果显示PN12时OIR模型组小鼠视网膜无灌注区明显增加,PN17时OIR模型组小鼠视网膜可见大量散在RNV,无灌注区面积较PN12时有所减小。视网膜冰冻切片免疫荧光染色结果显示PN12时OIR模型组小鼠视网膜中央血管分布明显减少,PN17时OIR模型组小鼠视网膜中央区域则可见明显瘤样、团簇样新生血管簇,说明OIR动物模型构建成功。2.蛋白质组学分析结果提取PN12和PN17两个时间节点对照组和OIR模型组小鼠视网膜,测定视网膜总蛋白浓度为1.0-1.8μg/mL。SWATH-MS方法共检测到5190个蛋白,PN12、PN17分别检测到283个和188个差异蛋白。PN17时OIR模型组上调蛋白中FC最大的为FN1,GO富集分析结果显示其参与创伤反应和创伤愈合等,PN17时OIR模型组下调程度最高的蛋白为SPRED3,调节生长因子诱导的MAP激酶级联激活。KEGG结果显示PN12的差异蛋白主要富集于同源重组、内吞作用、氧化磷酸化和胰岛素信号通路;PN17的差异蛋白主要富集于RNA转运、亨廷顿病和PPAR信号通路。STRING数据库分析结果发现19个与内皮细胞调节相关的目标蛋白,包括Anxa2、Anxa3、Anxa5、Apoa1和Vash1等。在19个目标蛋白中,78.9%表达于小鼠内皮细胞,57.9%表达于人内皮细胞,且Apoa1、Fgb、Fgg和Sparc均与其他目标蛋白具有较多的相互作用。qRT-PCR验证目标蛋白mRNA在原动物模型中表达水平与蛋白质组学结果相一致。3.细胞模型验证差异基因表达成功构建hRMECs体外相对缺氧细胞模型,细胞增殖实验验证高氧抑制hRMECs增殖,相对缺氧则上调hRMECs中VEGF mRNA的表达水平。相对缺氧后细胞中Anxa2、Anxa5和Vasp等基因的表达上调,Vash1基因表达下调,说明缺氧可能通过调节这些基因的表达水平从而影响hRMECs的增殖能力。结论:1.成功构建C57BL/6小鼠OIR动物模型,其视网膜新生血管变化情况符合该模型的病理特征,为后续研究提供实验动物基础。2.通过OIR小鼠视网膜蛋白质组学分析,发现多种参与内皮细胞功能调控的差异蛋白,包括Anxa2、Anxa3、Anxa5和Vasp等,这些蛋白可能是影响OIR小鼠RNV形成的关键蛋白。3.在相对缺氧可刺激hRMECs增殖,Anxa2、Anxa5和Vasp等mRNA表达水平上调,Vash1表达水平下调,与PN17时蛋白质组学的结果相一致,进一步说明蛋白质组学所筛选的目标蛋白在RNV形成中发挥重要作用,为今后探究RNV机制和视网膜缺血缺氧性疾病提供了潜在靶点。