研究目的中医认为,舌苔乃胃蒸脾湿上潮而生。本研究以江苏地区最常见恶性肿瘤胃癌为基础病种,对胃癌患者舌苔形成的分子遗传学研究,选择与舌苔形成相关的标志分子EGF、TGF-α、EGF-R和E-cad (CDH1)为研究对象,在基因组学水平上揭示EGF、TGF-α、EGF-R和E-cad基因多态性与胃癌患者舌苔形成之间的关系,以期通过研究,在基因水平上探讨影响胃癌患者舌苔形成的分子遗传学机制,为中医舌诊在胃癌临床诊断上提供新的理论依据。研究方法本研究通过临床病例-对照法,选择胃腺癌患者258作为病例组,经体检并无特殊不良嗜好的健康人群261例作为对照组。按照《中医诊断学》(吴承玉主编2011版)标准,将两组人群按舌苔不同进行分类,分为病理性厚苔和病理性薄苔和正常舌苔。收集两组人群外周血,利用PCR-LDR法检测EGF、TGF-α、EGF-R和E-cad的SNP位点,获得相应SNP基因型和等位基因频率的信息,应用ELISA法检测血清中EGF、TGF-α、EGF-R和E-cad的表达水平,并通过对上述基因的SNP基因分型、EGF、TGF-α、EGF-R和E-cad的表达水平、胃癌临床分期、病史、舌苔类型、人口学特征、生活方式等因素进行关联分析,探讨胃癌患者舌苔形成和变化的分子遗传学机制。研究结果1、本项目研究对象的人口学特征。胃腺癌病例组258例,其中男性180例,平均年龄60.61岁±10.83岁,女性78例,平均年龄56.14岁±13.68岁,对照组261例,其中男性158例,平均年龄51.36岁±13.94岁,女性103例,平均年龄50.34岁±13.35岁。2、胃癌发生与生活习惯的关系。胃腺癌组不按时吃饭的比例高于对照组(χ2=9.124,P=0.010),胃腺癌组与对照组相比饮食口味偏咸(χ2=74.409,P<0.001),吸烟率高于对照组(χ2=18.019, P<0.001),胃腺癌组经常吃豆制品的频率明显低于对照组(χ2=10.669, P=0.014),并且其经常吃新鲜水果的频率明显低于对照组(χ2=59.905,P<0.001)。病例组有饮酒史者占29.2%,对照组有饮酒史者占17.3% (P<0.001)。3、本研究以8种基本证型对258例胃癌病例进行了辨证分析。在证型分布上,具有证型相兼(57.63%)的总例数明显大于单一证型者(36.69%);在单一证型的分布中,以脾胃虚弱型(22.11%)、胃热阴伤型(20%)、气血两虚型(15.79%)、湿热蕴毒型(12.63%)为多见。在所有的证型中,虚实夹杂(46.90%)为其主要类型。4、EGF基因10个SNP位点及其分子与胃癌患者舌苔形成的相关性研究结果。其外显子区域rs2237051的基因分布差异显著。多因素logistic回归分析rs2237051发现,与AA基因型相比,AG/GG基因型提高胃癌发病风险(调整OR=1.577; 95%CI=1.163-2.138)。3’UTR区域rs3733625AG基因型与AA基因型比较,可降低胃癌发病风险(调整OR=0.714; 95%CI=0.512-0.996)。进一步分析,在肠型胃癌患者中以及大于50岁的男性饮酒人中,rs2237051危险效应和rs3733625保护效应均具有统计学意义。rs2237051在白色苔中,和野生的AA型相比,突变杂合AG和突变纯合GG可以降低胃癌的发生(P=0.034); rs2237051在厚苔中,和野生的AA型相比,突变杂合AG和突变纯合GG可以降低胃癌的发生(P=0.045),其余的苔色、苔质以及多态位点均没有显著性关联(P>0.05)。胃癌组白细胞数、淋巴细胞数、总蛋白降低者,其薄苔比例下降,厚苔、剥苔比例增高,P<0.001;总蛋白降低时胃癌组比正常人血清EGF表达降低,P<0.01,而白细胞、淋巴细胞数异常时胃癌组与正常对照比较,EGF表达无明显差异。5、EGF-R基因11个SNP位点及其分子与胃癌患者舌苔形成的相关性研究结果。(1)胃癌组血清EGF-R水平高于对照组(P<0.05),特别是淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比、血红蛋白等临床检验指标正常的白苔或薄苔人群。血清EGF-R水平与年龄无关(P>0.05)。(2) EGF-R基因外显子区,SNP rs28384375只有T等位基因,除了 SNP rs2072454 T等位基因增加胃癌风险(P=0.05)外,其他5个SNP均与胃癌风险无显著相关性。通过构建单倍型,发现ACAGCG和ACAGCA与胃癌发生显著相关(OR=0.67,95%CI=0.49-0.92; OR=0.75,95%CI=0.57-1.00)。(3) EGF-R 基因功能区 rs6965469、rs884225、rs884904和rs763317的等位基因、基因型在胃腺癌组和正常对照组的分布无统计学差异。由rs6965469、rs884225和rs884904构建的单倍型,单倍型TGA显著增加胃腺癌的患病风险(OR=3.52, 95%CI=2.34-5.29),而单倍型TAG则显著降低胃腺癌的患病风险(OR=0.41,95%CI=0.26-0.64)。(4) SNPrs1050171 和 rs2293347 的变异对胃癌患者和正常对照人群的苔色产生影响。SNPrs17337023、rs1050171和rs2293347的变异对胃癌患者和正常对照人群的苔质产生影响。SNP rs1050171和rs2293347的变异对胃癌患者和正常对照人群的苔色、苔质变化均产生影响,特别是SNPrs2293347的影响更明显。6、TGF-α基因8个SNP位点及其分子与胃癌患者舌苔形成的相关性研究结果。血清TGF-α的含量胃腺癌组明显低于正常对照组(P<0.05);从苔色方面分析,胃腺癌白苔组明显低于正常对照组(P<0.05),从苔质方面分析,胃腺癌厚苔组明显高于正常对照组(P<0.05),胃腺癌剥苔组明显低于正常对照组(P<0.05);胃腺癌患者血清TGF-α的含量黄厚苔组明显高于剥苔组(P<0.05)。7、E-cad (CDH1)基因4个SNP位点及其分子与胃癌患者舌苔形成的相关性。研究发现胃癌患者舌苔类型、组织学类型与E-cad (CDH1)基因SNP、血清sE-cad水平、临床检验结果存在相关性,未发现血清sE-cad水平与E-cad (CDH1)基因SNP之间存在相关性。研究结论1.胃癌发生与生活习惯具有密切的关系。不按时吃饭、饮食口味偏咸、吸烟、饮酒等不良生活习惯对胃癌发生率明显增高,吃豆制品和吃新鲜水果胃癌发生的频率明显低于对照组。2.经辨证分析,8种基本证型中胃癌患者的单一证型的分布中,以脾胃虚弱型、胃热阴伤型、气血两虚型与湿热蕴毒型最为多见;在相兼的证型中,瘀血内阻证与肝胃不和证最多。证型兼夹、虚实夹杂是胃癌证型的主要存在状态。3.研究发现一个新的与胃癌发病危险相关的EGF基因SNP位点—外显子区域rs2237051,其AG/GG基因型可以提高胃癌发病风险,推测基因型变化可能对EGF的结构、功能或分泌水平产生的影响,可今后进一步探讨研究。3’UTR区域rs3733625 AG基因型具有保护效应。rs2237051基因型的变化基于舌苔表现上与胃癌发病具有密切关系。胃癌组血清EGF明显高于正常组人群,胃癌与EGF的表达成正向相关。研究发现白薄苔、白厚苔病人血清EGF含量均明显高于对照组,且胃癌组人群黄薄苔EGF表达>黄厚苔,黄薄苔>剥苔,血清EGF水平与舌苔厚薄没有线性关系。因此我们推测人血清EGF含量并不是影响舌苔形成的唯一因素,微生物寄居、身体状况、临床治疗、其他细胞因子(如TGF)等多种因素都可能引起舌苔变化。胃癌患者免疫细胞的数量下降、肝肾功能改变都可在舌苔形成上产生影响,出现异常检查结果的患者舌苔剥苔、厚苔比例增高,且胃癌血清EGF表达与正常对照组比较反而降低(总蛋白降低时)或者差异不显著(白细胞、淋巴细胞异常时)。4.研究表明:(1)胃癌组血清EGF-R水平升高,且与年龄无关;EGF-R基因外显子区,SNPrs28384375 T基因型,增加胃癌风险,其他5个SNP均与胃癌风险无显著相关性。(2)通过构建单倍型,发现ACAGCG和ACAGCA与胃癌发生显著相关;(3)EGF-R基因功能区rs6965469、rs884225、rs884904和rs763317的等位基因、基因型在胃腺癌组和正常对照组的分布无统计学差异。有意义的是,由rs6965469、rs884225和rs884904构建的单倍型,单倍型TGA显著增加胃腺癌的患病风险,而单倍型TAG则显著降低胃腺癌的患病风险。(4) SNP rs1050171和rs2293347的变异对胃癌患者和正常对照人群的苔色产生影响。SNP rs17337023、rs1050171和rs2293347的变异对胃癌患者和正常对照人群的苔质产生影响。SNPrs1050171和rs2293347的变异对胃癌患者和正常对照人群的苔色、苔质变化均产生影响,特别是SNPrs2293347的影响更明显。5.血清TGF-α表达水平的变化与胃腺癌的发生发展密切相关;胃癌患者舌苔类型与血清TGF-α表达水平存在相关性,未发现TGF-α基因8个SNP与胃癌发生和舌苔类型具有相关性。6.发现胃癌患者舌苔类型、组织学类型与E-cad (CDH1)基因SNP、血清sE-cad水平、临床检验结果存在相关性,血清sE-cad水平与E-cad (CDH1)基因SNP不存在相关性。这些研究结果揭示了 EGF、EGF-R、TGF-α以及E-cad (CDH1)基因位点和血清相关分子表达在胃癌患者舌苔形成中的分子遗传学机制,发现了中医舌苔辨证在恶性肿瘤-胃癌中的科学价值,为胃癌的早期诊断起到辅助作用,也为以后开展转化医学研究奠定了基础。