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在全球范围内,恶性肿瘤已经成为致死率最高的疾病。炎症是导致肿瘤发生和进展确切的因素之一,约20%的癌症源于慢性感染刺激。Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)属于模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs),参与机体的免疫调控和炎症反应。研究表明多种肿瘤组织及肿瘤细胞系高表达TLR4且与其免疫逃逸密切相关。中晚期癌症患者镇痛多依赖吗啡,但研究表明吗啡的需求量和患者预后呈负相关。吗啡体内主要代谢产物吗啡-3-葡糖苷酸(Morphine-3-glucuronide,M3G)可激活神经系统TLR4,促进细胞因子释放参与吗啡耐受。但M3G与肿瘤细胞表达TLR4相互作用及对肿瘤生物学行为影响尚无报道。本课题拟探索吗啡主要代谢产物M3G与非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)表达TLR4相互作用对肿瘤生物学尤其是免疫逃逸的影响,旨在从肿瘤免疫微环境角度阐述肿瘤患者应用吗啡预后不良的机制,从而为优化癌痛治疗提供依据。为此,本课题首先开展临床病例回顾性研究。选取126例接受肺癌根治术及吗啡镇痛治疗且随访资料完整的NSCLC患者,通过对癌及癌旁组织标本进行免疫组化染色,发现肿瘤组织高表达TLR4而不是吗啡经典受体μ阿片受体(Mu-opioid receptor,MOR),且TLR4表达与患者肿瘤TNM分期、淋巴结转移等临床病理资料密切相关。生存分析结果表明,肿瘤组织TLR4表达水平与患者术后总生存期(Overall survival,OS)及无病生存期(Desease free survival,DFS)负相关且是患者预后不良的独立风险因素。利用免疫组化技术,我们也进一步分析了肿瘤组织程序性细胞死亡因子配体-1(Programmed cell death ligand1,PD-L1)表达,虽然PD-L1表达与患者术后OS及DFS无显著相关性,但我们发现接受镇痛治疗患者肿瘤组织TLR4表达水平与PD-L1表达成正相关,这为我们后续体内实验提供了临床依据。接下来,我们应用Discovery Studio 2.1软件中的CDOCKER模块(半柔性对接程序),进行配体分子与受体活性位点对接实验。结果显示M3G及吗啡与TLR4-髓样分化蛋白2(Myeloid differentiation protein 2,MD2)结合优于其初始配体,而吗啡另一代谢产物吗啡-6-葡糖苷酸(Morphine-6-glucuronide,M6G)与MD2结合能力较弱。细胞学实验中,我们首先利用western blot及RT-q PCR技术筛选出高表达TLR4的NSCLC细胞系A549及H1299。通过共孵实验表明不同浓度M3G及TLR4内源性配体脂多糖(Lipopolysacchari-des,LPS)可促进A549及H1299细胞系膜表达PD-L1水平,且该作用可被TLR4通路抑制剂TAK-242所拮抗。流式细胞仪分析进一步证实M3G处理对A549及H1299细胞系其他膜表达免疫检查点分子如PD-L2、Gal-9、CD200等表达水平无显著影响。ELISA实验表明M3G与肿瘤细胞共孵可促进A549细胞系炎性因子IL-6表达。M3G还可促进A549及H1299细胞系迁移及侵袭能力。随后我们探索了M3G通过TLR4促进NSCLC细胞系PD-L1表达的信号转导机制。通过western b lot检测M3G处理A549细胞后主要信号通路如MAPK、PI3K、及NFκB信号通路关键蛋白磷酸化水平变化,发现M3G可激活PI3K及NFκB信号通路,且该作用可被TAK-242所拮抗。进一步通过流式细胞仪技术,我们发现PI3K信号通路抑制剂而不是NFκB信号通路抑制剂可逆转M3G引起的PD-L1表达升高。最后,我们进行了细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)靶细胞杀伤实验。通过HLA配型实验,选择与靶细胞A549细胞系HLA-A分型相符供体血标本。利用合成多肽负载,不同细胞因子刺激树突细胞成熟并最终获得CTL。细胞毒性实验及ELISpot结果表明,M3G可抑制CTL对A549细胞系的杀伤能力及CTL细胞因子INF-γ释放水平,从而促进NSCLC细胞系免疫逃逸。通过以上实验,本研究得出结论,接受吗啡镇痛治疗NSCLC患者肿瘤组织TLR4表达与PD-L1表达呈正相关。吗啡主要代谢产物M3G可与NSCLC细胞系表面TLR4特异性激活,通过PI3K信号通路上调PD-L1表达,从而抑制CTL细胞毒性功能及杀伤能力。此外,M3G还可促进NSCLC细胞迁移及侵袭能力,上调炎性因子IL-6释放水平,从而促进肿瘤免疫逃逸。