第一章大鼠肝移植动物模型的建立与改良　　 目的：探讨大鼠肝移植实验动物模型的建立方法和手术技巧，对经典的“二袖套法”肝移植动物模型进行技术改良，为开展诱导肝移植免疫耐受的实验研究提供良好的实验动物模型平台。　　 方法：实验分为两个阶段：预实验阶段和正式实验阶段。预实验分为两个阶段：第一阶段和第二阶段。预实验第一阶段：封闭群SD-SD大鼠组间行大鼠原位肝移植模型80例，主要是对模型的手术技巧方面的训练；预实验第二阶段：封闭群SD-SD大鼠组间行大鼠原位肝移植模型20例，主要是提高手术模型的稳定性。经过预实验第一阶段模型训练，预实验第二阶段已建立基本稳定的大鼠肝移植动物模型，统计手术过程主要步骤所用时间。正式实验阶段分2组：同品系组SD-SD大鼠组间10例和异品系组Wistar-SD大鼠组间10例，观察正式实验两组大鼠术后一般情况，以及术后生存时间的比较。　　 结果：成功对经典的“二袖套法”进行技术改良，成功建立大鼠原位肝移植实验动物模型。预实验第一阶段的各项主要手术步骤时间与预实验第二阶段相比，包括供体手术时间(43.6±7.3min vs28.6±3.6min)、供肝修整时间(18.6±4.7min vs10.4±3.2min)、受体手术时间(77.3±9.8min vs51.4±4.8min)以及无肝期(21.6±3.4min vs17.2±1.2min)，差异具有统计学意义(P＜0.01)。预实验第二阶段与正式实验阶段各项主要手术步骤时间相比，差异没有统计学意义(P＞0.05)。预实验第一阶段术后24h存活率为18.8％，术后1w存活率为6.3%。预实验第二阶段术后24h存活率为95.0%，术后1w存活率为85.0%。预实验阶段，两组大鼠术后生存时间比较，差异具有统计学意义(P＜0.001)。正式实验阶段，同品系组大鼠术后能够长期存活，异品系组大鼠术后产生急性排斥反应，预后效果不佳。同品系组与异品系组预后生存时间比较，差异具有统计学意义(P＜0.001)。　　 结论：改良的“二袖套法”大鼠原位肝移植术可在单人直视下进行，手术成功率较高，实验方法安全可靠。良好的手术技巧以及对细节加以注意是大鼠肝移植模型构建成功的关键。Wistar-SD大鼠肝移植是急性肝移植排斥模型，可作为研究肝移植免疫耐受的较好的动物模型。　　 第二章外周血淋巴细胞的分离、凋亡诱导和检测　　 目的：探讨应用大鼠淋巴细胞分离液分离大鼠外周血淋巴细胞方法的可行性，通过医用直线加速器照射诱导大鼠外周血淋巴细胞凋亡的方法以及流式细胞仪对于凋亡淋巴细胞的凋亡率检测。　　 方法：根据密度梯度离心法原理，应用大鼠淋巴细胞分离液将大鼠外周血淋巴细胞进行分离，然后将上述分离的外周血淋巴细胞分为4组，其中A组为对照组，B、C、D组为实验组，应用医用直线加速器进行照射，各组吸收剂量分别为1.0Gy、2.0Gy和3.0Gy。各组细胞经直线加速器照射处理后分别置于37℃，5%CO2恒温培养箱进行培养，各组细胞分别培养2h、4h、8h和12h，然后流式细胞仪检测各组之间不同时间点淋巴细胞的凋亡率。倒置显微镜下分别观察各组细胞形态变化情况。流式细胞仪测定细胞凋亡情况，采用AlmexinV-FITC/PI双标法。　　 结果：大鼠淋巴细胞分离液能够很好地分离大鼠外周血淋巴细胞。大鼠外周血淋巴细胞分离后，倒置显微镜下可见大量淋巴细胞呈透亮圆形，单核。5%台盼兰染色，细胞存活率约为96.5%。B、C、D组随着培养时间的延长，部分淋巴细胞皱缩变小，蓝染细胞明显增加。医用直线加速器照射能够诱导外周血淋巴细胞凋亡，各组之间照射剂量不同，淋巴细胞凋亡率也不相同。对照组也存在一定量的细胞凋亡，对照组和B组凋亡率随着培养时间增加而增加，培养8h时达到最大凋亡率（33.4±2.3%和41.2±2.8%），之后随着时间推移到培养12h时凋亡略有减少(30.3±3.4%和37.5±3.7%);C组于培养4h后即有显著凋亡发生达到凋亡高峰(46.1±3.2%)，但随后培养8h和12h凋亡率逐渐下降:D组同样于培养4h后达到凋亡高峰(43.2±3.0%)，但是随后各培养时间点凋亡率升高不显著。对照组各时间段凋亡率均为最低；C组在培养4h时即达到最大凋亡高峰，诱导的淋巴细胞凋亡率高，重复性强。总体上，照射处理组与对照组比较，各培养时间段细胞凋亡率差异具有显著性(P＜0.01）。　　 结论：直线加速器照射能够诱导大鼠外周血淋巴细胞凋亡，该诱导细胞凋亡的方法简单、实用、有效。直线加速器高能X线照射剂量2.0Gy和培养4h能够简便而有效地诱导大鼠外周血淋巴细胞凋亡，该方法诱导的淋巴细胞凋亡率高，重复性强，可以力开展肝移植免疫耐受的实验研究提供良好的平台。　　 第三章预输注供者外周血凋亡淋巴细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的研究　　 目的：研究预输注通过直线加速器照射处理后的供者外周血凋亡淋巴细胞是否可以成功诱导大鼠肝移植免疫耐受的形成，为临床上成功诱导肝移植免疫耐受提供新的思路和可行的方法。　　 方法：实验分三组，对照组(A组)：供、受体大鼠无特殊处理，行肝移植手术；单纯供者淋巴细胞输注组(B组)：术前7d经受体阴茎背静脉输注供者外周血淋巴细胞；供者凋亡淋巴细胞输注组(C组)：术前7d经受体阴茎背静脉输注经直线加速器照射的外周血凋亡淋巴细胞。每组之间均做Wistar至SD的肝移植模型，每组各12只Wistar、SD大鼠。观察术后受体大鼠的生存期状况、术后第7d的肝功能(ALT、TBil)变化的检测和光镜下肝组织病理改变的观察以及术后3d、7d和10d的血清细胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ)的检测。　　 结果：A组大鼠术后生存时间为7～15d，中位生存期(MST)为11d;B组大鼠术后生存时间为12～43d，MST为29d;C组生存时间为42～100d，MST为100d。各实验组之间生存时间比较，差异具有统计学意义(P＜0.001)。A组大鼠血清ALT、TBil明显高于其它两组(P＜0.001)。B组和C组之间ALT和TBil相比较，同样具有显著性差异(P＜0.001)。术后肝组织病理检测表明，A组呈现急性重度排斥反应，B组呈现急性中度排斥反应，C组呈现急性轻度排斥反应。血清IL-2术后均有所上升，其中对照组上升幅度最大，三组之间比较差异具有统计学意义(P＜0.001）；血清IL-4和IL-10变化较一致，对照组术后血清IL-4和IL-10有所下降，B组和C组明显上升，C组上升幅度最大，与A组以及B组在各个时间点比较，差异均有统计学意义(P＜0.001)；血清IFN-Υ术后3d均有所升高，到第7d均达到最大值，差异具有统计学意义(P＜0.001)。　　 结论：预输注直线加速器照射处理的供体外周血凋亡淋巴细胞能够诱导大鼠肝移植免疫耐受的形成。供体凋亡外周血淋巴细胞的预输注可使受体移植后Th2细胞因子(1L-4、IL-10)的水平上调以及抑制Th1细胞因子(IL-2、IFN-γ)的表达，说明凋亡细胞诱导移植免疫耐受可能与调节Th1/Th2平衡有关，即促使Th0细胞向Th2细胞分化而抑制Th1细胞生成。