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研究背景随着人们生活节奏的加快和工作压力的骤增,心脑血管疾病已经严重威胁人民生命健康,其中脑卒中的发病率、致残率和病死率逐年提高,尤其是脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)造成的危害极为严重。目前临床仍然缺乏治疗CIRI的有效手段,因此寻找安全优效的防治药物成为研究的热点。传统中医药是我国宝贵的医疗资源,具有药物研发的独特优势。通过研究中药药效物质的作用及机制,对于抗CIRI的传统药物升级和制定治疗策略具有重要意义。中医对缺血性脑卒中的研究具有悠久历史,认为该病属于血瘀证范畴,气虚是致病的根源,血瘀是疾病发生发展的核心,因而将活血化瘀和活血益气作为治疗该病的常用方法。临床上治疗CIRI的常用中药有红花(Carthamus tinctorius L.)、丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)、黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge)等,大量研究表明,这些中药的主要药效活性成分羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A,HSYA)、丹参素(Danshensu,DSS)和黄芪甲苷(Astragaloside IV,AST-Ⅳ)对CIRI具有治疗作用。依照传统中医的整体观,临床上治疗CIRI以中药方剂和复方制剂为主,药对是中医方剂配伍的核心。红花-丹参、红花-黄芪分别作为具有活血化瘀和活血益气作用的经典药对,不仅是许多经典方剂的核心药物,而且是临床治疗心脑血管疾病的常用有效药物。虽然HSYA分别与DSS和AST-Ⅳ配伍已经有效运用于部分心脑血管疾病的防治,但是它们在CIRI的协同作用及机制研究却鲜有报道。HSYA作为目前临床用药中为数不多的中药注射剂主要成分之一,不仅是红花黄色素活血化瘀功效的主要有效成分,而且是药用红花的药理活性中最有效的水溶性成分,但是HSYA抗CIRI的作用机制至今并未充分阐明。CIRI的病理生理机制非常复杂,中药效应组分繁多,传统分子生物学的单一通路和单一效应研究策略未能充分揭示中药的脑保护作用机制。近年来,蛋白质组学技术的快速发展为本研究运用非标记定量和生物信息学技术筛选并分析HSYA抗CIRI的差异蛋白及其关键蛋白提供了良好契机,也为揭示HSYA分别与DSS和AST-Ⅳ配伍抗CIRI的作用机制研究提供了新思路。研究目的1.通过非标记定量和生物信息学技术,筛选并分析HSYA抗大鼠CIRI的差异蛋白,并采用Western blot对关键蛋白进行验证,初步确定红花组分的多效应作用,为血瘀证脑卒中的证本质研究提供实验依据;2.通过HSYA和DSS单用及配伍抗大鼠CIRI效果的对比研究,阐明HSYA和DSS的协同活血化瘀功效对CIRI的治疗作用及机制;3.通过HSYA和AST-Ⅳ单用及配伍抗大鼠CIRI效果的对比研究,阐明HSYA与AST-Ⅳ的协同活血益气功效对CIRI的治疗作用及机制。研究方法1.SD大鼠60只随机分为假手术组、模型组和HSYA组,每组20只。采用线栓法复制MCAO模型,按照Zea Longa法进行神经功能缺损评分;脑缺血再灌注72 h,用TTC染色和Image Pro Plus 7.0计算脑梗死体积;HE染色观察病理学形态变化,TUNEL染色观察细胞凋亡变化。运用非标记定量技术筛选HSYA抗CIRI的差异蛋白;运用生物信息学技术分析这些差异蛋白的作用;通过Western blot对关键蛋白抗CIRI的作用机制进行验证。2.SD大鼠40只随机分为假手术组、模型组、HSYA组、DSS组、HSYA和DSS配伍组,每组8只。采用线栓法复制MCAO模型,按照Zea Longa法进行神经功能缺损评分;脑缺血再灌注48 h,用TTC染色和Image Pro Plus 7.0计算脑梗死体积;HE染色观察病理学形态变化,TUNEL染色观察细胞凋亡变化;ELISA Kit检测SOD、GSH-Px和MDA指标以观察其抗氧化作用,检测TNF-α、IL-1β和IL-6指标以观察其抗炎作用;Western blot分析TLR4/NF-κB以及Nrf2/HO-1水平;MTT测定OGD诱导的神经元LDH水平。3.SD大鼠100只随机分为假手术组、模型组、HSYA组、AST-Ⅳ组、HSYA和AST-Ⅳ配伍组,每组20只。采用线栓法复制MCAO模型,按照Zea Longa法进行神经功能缺损评分;脑缺血再灌注72 h,用TTC染色和Image Pro Plus 7.0计算脑梗死体积;HE染色观察病理学形态变化,SABC检测CD31表达;ELISA Kit检测SOD和GSH-Px指标观察其抗氧化作用,检测TNF-α和IL-1β指标观察其抗炎作用。研究结果1.通过非标记定量和生物信息学技术鉴定和分析HSYA抗大鼠CIRI的差异蛋白研究表明:mTOR和Rab11的表达上调及Ppp2r5e的表达下调与HSYA抗大鼠CIRI的作用相关。与模型组进行比较,HSYA治疗前后大鼠的神经功能缺损评分差异显著,HSYA组大鼠的脑梗死体积缩小,脑皮层梗死区的病理学形态变化较小,TUNEL阳性细胞减少(P<0.05)。非标记定量技术从HSYA效应相关的9107个蛋白中筛选出1982个差异表达蛋白,发现13个差异蛋白出现了高表达,其中mTOR、Rab11、Ppp2r5e、Eno2、Gfap蛋白与HSYA抗大鼠CIRI有关。Western blot对关键蛋白的验证结果表明,上调mTOR和Rab11表达及下调Ppp2r5e表达能缓解大鼠CIRI,其作用机制可能与抗炎、抗细胞凋亡和促进血管新生相关。2.HSYA和DSS单用及配伍抗大鼠CIRI效果的对比研究表明:HSYA与DSS配伍的协同活血化瘀作用能增强抗CIRI的疗效。虽然HSYA和DSS单用均有抗大鼠CIRI的作用,但是两者配伍能更好地改善神经功能缺损、减少脑梗死体积和脑皮层梗死区的病理学形态变化以及TUNEL阳性细胞计数(P<0.05)。与HSYA组和DSS组相比,HSYA和DSS配伍组的SOD和GSH-Px活性分别提高了11.8、16.8和3.9、12.9,TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA分别降低了39.7、41.9,10.6、6.3,49.5、31.9和5.38、16.82(P<0.05);TLR4/NF-κB水平显著下调,Nrf2/HO-1水平明显上调,OGD诱导的神经元细胞LDH水平显著提高,其作用机制可能与炎症反应和氧化应激相关。3.HSYA和AST-Ⅳ单用及配伍抗大鼠CIRI效果的对比研究表明:HSYA与AST-Ⅳ配伍的协同活血益气作用能增强抗CIRI的疗效。与HSYA和AST-Ⅳ单用组相比,HSYA和AST-Ⅳ配伍组抗大鼠CIRI的效果更为显著。治疗前后神经功能缺损评分差异显著,脑梗死体积和脑皮层梗死区的病理学形态变化明显减少,CD31细胞水平显著提高(P<0.05);与单用组相比,HSYA和AST-Ⅳ配伍组的SOD和GSH-Px活性分别提高了3.9、11.5和8.9、16.9,TNF-α和IL-1β分别降低了3.7、5.9和12.9、7.3(P<0.05),其作用机制可能与促进血管新生、抗氧化和抗炎相关。研究结论本研究首次运用非标记定量和生物信息学技术发现了mTOR、Rab11和Ppp2r5e蛋白具有抗大鼠CIRI的作用,Western blot分析验证了mTOR和Rab11的表达上调及Ppp2r5e的表达下调能够缓解大鼠CIRI,其作用机制可能与炎症反应、氧化应激和神经元细胞凋亡相关,为缺血性脑卒中的证本质研究提供了可靠的实验依据。本研究通过比较HSYA分别与DSS和AST-Ⅳ配伍的协同作用,初步揭示了具有活血化瘀疗效的红花-丹参药对及活血益气疗效的红花-黄芪药对治疗CIRI的作用及机制,证实了中药多成分多靶点的协同作用,为缺血性脑卒中的防治提供了研究的新思路。