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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和生长期猪的呼吸道症状为特征的高度传染性疾病,给世界范围的养猪业造成了巨大的经济损失。中和抗体在抵抗PRRSV的感染中起到至关重要的作用,PRRSV的GP5蛋白作为病毒囊膜的重要组成部分,被认为是诱导中和抗体的主要蛋白,也较多应用于PRRSV基因工程疫苗的研究。然而以GP5作为目标基因的亚单位疫苗往往不能诱导较高滴度的中和抗体,并且交叉保护性较差,该蛋白在免疫保护中的地位目前也存在一定争议。因此通过体外高效表达GP5蛋白,并分析其诱导中和抗体的能力,将为探讨GP5在PRRSV免疫保护中的作用及其在PRRSV防控中的应用提供一定理论参考。实验一旨在以原核表达系统表达缺失跨膜区和信号肽的截短GP5重组蛋白。本研究首先利用Marc-145细胞对实验室所保存的PRRSV美洲株VR2332进行增殖,通过RT-PCR方法扩增出完整的ORF5基因,连接至PMD18-T载体构建重组质粒PMD18T-ORF5并进行测序。根据ORF5基因的测序结果,设计两对引物,其中一对引物用于扩增ORF5基因上编码N-端多肽的核酸片段(ORF5N),另一对引物用于扩增ORF5基因上编码C-端多肽的核酸片段(ORF5C),采用重叠延伸PCR技术(Gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)对两个片段进行连接,扩增出缺失跨膜区(66aa-125aa)和信号肽(1aa-31aa)序列的ORF5基因片段并连接至原核表达载体PET-32a,构建原核表达载体PET-ORF5NC。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导成功表达出大小为31.5KD的GP5重组蛋白,与预期的蛋白大小相符。经过对IPTG诱导表达的浓度、时间的优化,获得了重组蛋白的高效表达,以尿素法纯化包涵体蛋白并复性,分别以鼠抗His单克隆抗体和PRRSV阳性血清为一抗对重组蛋白进行Western blot检测,结果显示重组蛋白可以被鼠抗His单克隆体和PRRSV阳性血清所识别,表明重组蛋白具有良好的反应原性。实验二旨在以杆状病毒/昆虫表达系统表达全长的GP5重组蛋白,并表达缺失跨膜区、信号肽的截短GP5重组蛋白。根据实验一所获得的OFR5基因片段,再次设计两对引物,其中一对引物以质粒PMD18T-ORF5为模版,扩增出完整的ORF5基因片段(ORF5);另一对引物以质粒PET-ORF5NC为模版,扩增出缺失跨膜区、信号肽的ORF5基因片段(ORF5NC),分别连接至p Fast Bac-HTA供体质粒,将获得的两种重组供体质粒分别转化含有杆状病毒穿梭质粒的DH10-Bac细胞,经三重抗性和蓝白斑筛选,获得两种重组穿梭质粒Bacmid-ORF5和Bacmid-ORF5NC。将穿梭质粒分别转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒Ac MNPV-ORF5和Ac MNPV-ORF5NC;将两种重组杆状病毒分别感染Sf9细胞,以SDS-PAGE和Western blot对两种重组杆状病毒所表达的蛋白进行鉴定,结果表明,Sf9细胞中分别表达了大小约为22KD的全长的GP5重组蛋白和大小为17KD的截短的GP5重组蛋白,与预期的蛋白大小相符并均为非糖基化形式。大量表达重组蛋白,并以Ni柱亲和层析方法对两种重组蛋白进行纯化,经SDS-PAGE并以Image J软件进行灰度分析,目的蛋白纯度均达到90%以上,其中Ac MNPV-ORF5表达纯化产物为90.3%,Ac MNPV-ORF5NC表达纯化产物为92.6%。实验三旨在探讨所获得的三种GP5重组蛋白诱导PRRSV中和抗体产生的能力。将三种重组蛋白作为免疫原,分别免疫昆明小鼠制备三种抗血清,并分别以各重组蛋白和PRRSV全病毒作为ELISA包被抗原,检测抗血清的效价。结果表明,当以各重组蛋白作为ELISA包被抗原检测自身对应的抗血清时,抗原核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1:25600,抗真核表达的全长GP5蛋白抗血清效价为1:12800,抗真核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1:12800;当以PRRSV全病毒作为ELISA包被抗原检测抗血清时,抗原核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1:200,抗真核表达的全长GP5蛋白血清效价为1:800,抗真核表达的截短的GP5蛋白血清效价为1:1600。以本实验室已建立的中和试验方法将获得的三种抗血清分别在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)进行PRRSV的血清学中和试验,通过实时定量PCR方法检测各组中PRRSV m RNA的绝对拷贝数,以抗血清的病毒阻断率≥70%的最大血清稀释度作为该血清的中和效价。结果表明,三种重组蛋白抗血清的中和效价均<1:2,说明抗血清均不能中和PRRSV对PAM细胞的感染;而作为对照的抗PRRSV全病毒的阳性血清可以中和病毒对PAM细胞的感染,中和效价为1:8。