病毒性肝炎是我国的常见、多发病,其中乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是导致肝细胞癌的主要危险因子之一。乙型肝炎病毒变异性高,其基因组包括四个开放阅读框(C、P、S、X),其中HBx编码的蛋白是一种多功能性蛋白,为病毒基因组转录所必需,在乙型肝炎病毒的复制、细胞生长、DNA修复及凋亡过程中起重要作用。因此,对HBx进行深入研究具有极其重要的理论和临床意义。细胞毒性T淋巴细胞是细胞免疫应答的核心成分,通过受体与带有CTL表位即抗原肽的MHC-I类分子互相作用,溶解、杀伤靶细胞。抗原肽是抗原中能被免疫细胞特异性识别的线性片段或空间构象性结构,是引起免疫应答和免疫反应的基本单位,在机体免疫中发挥关键的作用,抗原表位的选择也是能否获得特异性抗体的关键。由于HBx表位可以被不同的MHC-Ⅰ类分子所识别、递呈,在这些MHC-Ⅰ类分子中,中国人群中HLA-A2阳性的人群高达50%,因此对HLA-A0201限制性的CTL表位进行研究具有更大的现实意义。迄今为止,HBV被分为八个不同的基因型(A-H),以及众多的血清型。我们选择了中国人群中最常见B基因型中的adw血清型和C基因型中的adr血清型的基因序列作为研究对象,分别通过三个提供表位预测服务的网络站点,以及超基序、延展基序和量化基序等方案预测获得4条九肽作为候选表位(HBx1:VLCLRPVGA、HBx2:CLFKDWEEL、HBx3:VLHKRTLGL、HBx4:HLSLRGLPV)。由于预测结合并不等于实际结合,并且实际结合也并不意味着真正具有免疫原性,所以有必要通过体内、体外实验对预测表位的结合能力、免疫原性进行进一步的免疫学鉴定。为此,我们根据文献分别选择了阳性肽(HBc:FLPSDFFPSI)以及阴性肽(HBc,HLA-A2402:EYLVSFGVW)作为阳性、阴性参照。T2细胞作为一种免疫学研究的工具,其表面空载的HLA-A0201分子表达极不稳定,而外源性抗原肽的结合能够提高HLA-A0201分子的稳定性,因此我们通过T2细胞结合实验和结合稳定性实验检测各候选表位与HLA-A0201分子结合的亲和力、稳定性,四条候选表位中HBx2的亲和力和稳定性最高。为了进一步检测各候选表位在体内环境中的免疫原性,我们以HLA-A2.1/kb转基因鼠为模型,模拟体内环境,对四条候选表位刺激脾细胞释放IFN-γ的能力和诱导的肽特异性CTL的细胞杀伤能力进行了检测,四条候选表位中HBx2同样表现出较高的刺激脾细胞释放IFN-γ和诱导的肽特异性CTL的细胞杀伤的能力。之后我们分离了HLA-A0201阳性慢性活动期乙肝病人外周血中的单个核细胞,通过检测HBx2和各对照肽体外刺激单个核细胞分泌IFN-γ的能力和诱导的肽特异性CTL的细胞杀伤能力,对HBx2的免疫原性作进一步的鉴定。根据体内、体外鉴定的结果,我们利用HBx2构建了可溶性的肽-四聚体,为将该表位进一步应用于临床诊断和治疗铺平了道路。综上所述,HBx2(CLFKDWEEL)是一个潜在的HBx来源的HLA-A0201限制性CTL表位,具备应用于临床诊断、治疗的可能性。我们的研究为进一步深入探讨HBx在乙肝和乙肝导致的肝细胞癌中的作用以及慢性乙肝、肝细胞癌的诊断、治疗研究打下了良好的基础。