研究背景肺癌是全世界最主要的恶性肿瘤之一,根据其病理类型可分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌。小细胞肺癌(SCLC)约占所有肺癌的15%左右,以细胞倍增时间短、肿瘤进展迅速、早期即可发生血液和淋巴转移为特点,是所有肺癌中恶性程度最高的肿瘤。尽管很多小细胞肺癌病人对放疗、化疗(顺铂、足叶乙甙、阿霉素)具有较好的早期反应性,但其极易发生多药耐药性,导致肿瘤治疗失败、疾病进展和复发。小细胞肺癌多药耐药性产生的机制是一个很复杂问题,且是近年来小细胞肺癌临床治疗亟需解决的重要问题之一。成纤维细胞生长因子诱导分子14(Fn14)基因,首次在鼠科动物内被称为生长因子诱导基因,是肿瘤坏死因子受体超家族中最小的成员,其分子量仅14kDA。Fn14编码了一个细胞外含有一个胱胺酸区域以及细胞质内含有一个肿瘤坏死因子受体相关因子结合区域但缺乏胞质内死亡区域的Ⅰ型跨膜蛋白。Fn14在很多正常组织如肾、肺、胰腺等中的表达是低的,然而在肿瘤组织中Fn14表达显著升高,且有研究表明：Fn14与神经胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌和非小细胞肺癌等肿瘤的疾病进展及不良预后密切相关,同时体内外实验均证明上调Fn14的表达可以促进肿瘤的生长、侵袭和转移。这些结果表明Fn14在肿瘤中充当致癌基因的作用。我们课题组前期工作表明Fn14在小细胞肺癣耐药细胞株H69AR中的表达显著高于其在SCLC敏感细胞株H69中的表达,因此我们推测Fn14可能参与了小细胞肺癌的生长和多药耐药性形成。研究表明NF-κB信号通路在肿瘤细胞增殖生长、血管生成、粘附以及侵袭转移中发挥重要的作用,同时也有证据表明上调Fn14的表达可以激活NF-κB信号通路,进而促进肿瘤细胞的生长。在胶质母细胞瘤、胃癌中,Fn14通过激活NF-κB信号通路增加其下游存活因子Bcl-xl/w的表达,最终促进肿瘤的生长。因此我们推测NF-κB信号通路可能参与了Fn14调控小细胞肺癌生长和多药耐药的过程。为了进一步明确Fn14在SCLC中的潜在生物功能,我们首先分析了Fn14在SCLC组织、耐药细胞株和敏感细胞株中的表达,然后通过上调或下调Fn14的表达研究了Fnl4对SCLC生长和多药耐药性的影响,最后我们还对Fn14调控SCLC生长及耐药性的机制进行了研究。结果发现1.Fn14在SCLC组织中是高表达的且与肿瘤的不良预后有关,2.上调Fn14的表达可以促进SCLC的生长及增加其耐药性,3.NF-κB信号通路通过影响其下游靶基因Bcl-xl的表达,参与了Fn14调控SCLC生长和耐药性的过程。结果表明Fn14在调控小细胞肺癌生长和多药耐药性中起着重要的作用,有望成为小细胞肺癌临床治疗的潜在靶点。目的比较SCLC多药耐药细胞株(H69AR)和敏感细胞株(H69)中基因表达差异,选取显著表达差异基因Fn14进行研究,分析其对SCLC生长、耐药性的影响及其调控机制,同时选取了另一对细胞株(H446AR和H446)共同验证了Fn14在调控SCLC生长、耐药性中作用,进一步丰富SCLC多药耐药性的分子机制,为临床治疗提供理论依据。内容与方法一、分析SCLC多药耐药细胞株H69AR和H446AR及敏感细胞株H69和H446中Fn14基因表达的差异性。采用cDNA基因芯片技术分析SCLC多药耐药细胞株H69AR和敏感细胞株H69中具有差异表达的基因,选取显著表达差异的基因Fn14进行研究,通过实时荧光定量PCR和、Western Blot技术分析Fn14的nRNA和蛋白在耐药细胞株(H69AR、H446AR)及其敏感细胞株(H69、H446)中的差异表达;二、Fn14对小细胞肺癌增殖生长的影响。采用Fn14表达质粒和shRNA增加或降低SCLC多药耐药细胞株(H69AR、H446AR)和敏感细胞株中(H69、H446) Fn14表达水平,通过荧光定量PCR和、Vestern Blot技术验证转染效率。CCK-8及平板克隆实验分析了Fn14对小细胞肺癌细胞增殖的影响；同时通过体内实验进一步验证了Fn14在小细胞肺癌生长中的作用。三、Fn14在SCLC多药耐药性中的作用。采用Fn14表达质粒和shRNA增加或降低SCLC多药耐药细胞株(H69AR、H446AR)和敏感细胞株中(H69、H446)Fn14表达水平,通过荧光定量PCR和Western Blot技术验证转染效率。CCK8法分析细胞对小细胞肺癌常用化疗药物顺铂(Cisplatin, DDP)、足叶乙甙(Etoposide, VP-16)及阿霉素(Doxorubicin,ADM)敏感性的变化,流式细胞术分析细胞凋亡和周期的变化；四、NF-κB通路在Fnl4调控SCLC生长及多药耐药性中的作用。1、采用荧光定量PCR和Western Blot技术分析上调Fn14或下调Fn14表达后各细胞株中Bcl-xl的表达变化,明确Fn14对Bcl-xl表达的调节作用。2、构建一个pNF-κB的荧光素酶载体及pRL-CMV Vector,通过Lipofectainine2000共转染至各细胞株中,采用双荧光素酶报告基因测定方法检测NF-κB的荧光素酶活性,验证Fn14与NF-κB通路的关系。3、采用NF-κB通路抑制剂Celastrol,阻断NF-κB信号通路,观察其下游调控基因Bcl-x1表达的变化及SCLC细胞株增殖、耐药性的改变。五、Fn14在SCLC组织中的表达及临床病理意义收集51例SCLC患者石蜡包埋组织,免疫组化染色,分析Fn14表达与SCLC患者临床特征及生存率的关系。六、统计学分析所有结果均经SPSS16.0统计软件统计。数据以均数±标准差(x±s)表示,两株细胞间Fn14或Bcl-xl表达的比较采用独立样本t检验。多组间比较采用one-way ANOVA(方差齐同时)或Welch法(方差不齐时)。CCK-8实验结果采用析因设计资料的方差分析,多重比较采用SNK法。Fn14表达与临床病理特征分析采用列联表资料分析。多因素对SCLC患者生存时间的影响采用逐步Cox回归模型分析,各因素对SCLC患者生存时间的影响采用Kaplain-Meier分析。P<0.05被认为是有统计学意义。结果一、SCLC多药耐药细胞株H69AR和H446AR中Fn14的表达显著升高基因芯片结果显示Fn14在SCLC多药耐药细胞株H69AR中的表达是H69中的表达的5.4倍,实时荧光定量PCR结果显示：Fn14在耐药细胞株H69AR、H446AR中的表达分别是其在敏感细胞株H69、H446中表达的7.56倍(P<0.05)和6.31倍(P<0.05),Western Blot检测结果：H69AR中Fn14的表达是H69中的3.50倍(P<0.05) H446AR中Fn14的表达是H446中的2.48倍(P<0.05),结果验证了基因芯片及PCR的结果。二、上调Fn14表达能明显促进H69和H446细胞的增殖和生长1、成功构建了Fn14的表达质粒pcDNA3.1-Fn14以及阴性对照质粒pcDNA3.1。2、建立稳定高表达细胞株H69-Fn14、H446-Fn14将pcDNA3.1-Fn14及阴性对照pcDNA3.1转染入H69和H446细胞中,G418筛选出高表达Fn14的稳定转染细胞株H69-Fn14和H446-Fn14以及阴性对照细胞株H69-NC和H446-NC,荧光定量PCR和Western Blot检测显示：H69-Fn14细胞中Fn14的mRNA(4.52倍,P<0.05)和蛋白(4.05倍,P<0.05)表达水平显著升高,H446-Fn14细胞中Fn14mRNA(3.45倍,P<0.05)及蛋白(2.26倍,P<0.05)的表达也显著高于其对照组。3、CCK-8和平板克隆实验显示：H69-Fn14和H446-Fn14细胞的生长率较其相应对照组的生长率显著升高(P<0.05),H69-Fn14和H446-Fn14细胞的裸鼠皮下成瘤能力也明显的强于其对照组。三、下调Fn14表达能显著抑制H69AR和H446AR细胞的增殖和生长。1、建立稳定低表达Fn14的细胞株,首先采用lipofectamin2000将pGPU6/GFP/Neo-shFn14和GPU6/GFP/Neo-shNC质粒分别转染到H69AR和H446AR中,经过G418筛选出四株细胞株：H69AR-shFn14、H69AR-shNC、 H446AR-shFn14、H446AR-shNC。实时荧光定量PCR结果显示：抑制Fn14表达的质粒shRNA使细胞H69AR和H446AR中的mRNA水平分别降低了(71.49±4.48)%和(64.39±5.20)%; Western Blot显示：与相应的对照组相比,H69AR-shFn14和H446AR-shFn14中Fn14蛋白水平分别下降(65.23±5.35)%和(70.19±4.57)%。2、CCK-8法、平板克隆实验及裸鼠皮下成瘤实验分析结果显示,转染shFnl4下调Fn14的表达显著抑制了细胞的增殖生长,与阴性对照(negative control, NC)组和空白对照组相比具有显著差异(P<0.05)。四、上调Fnl4的表达明显增加H69和H446细胞的耐药性1、H69-Fnl4细胞对ADM、DDP和VP-16的生存率较H69-NC和H69细胞的生存率显著升高；在化疗药物ADM、DDP和VP-16的作用下,H446-Fn14细胞的生存率也显著高于H446-NC和H446细胞;50%抑制浓度(half maximal inhibitory concentration of a substance, IC50)亦升高。2、流式细胞术分析显示ADM、DDP和VP-16诱导的H69-Fn14和H446-Fn14细胞凋亡率较其对照组减少,且G2-M期细胞数增加。五、下调Fn14表达显著增加H69AR和H446AR细胞的药物敏感性1、CCK-8法分析结果显示,转染shFn14的H69AR细胞对ADM、DDP和VP-16的生存率较阴性对照(negative control, NC)组和空白对照组显著降低,IC50值亦显著降低。与其阴性对照(negative control, NC)组和空白对照组相比,H446AR-shFn14细胞对药物的生存率明显降低,IC50值亦降低。2、流式细胞术分析结果显示,ADM、DDP和VP-16处理后,转染shFn14的H69AR和H446AR细胞的凋亡率较其相应阴性对照组和空白对照组明显升高,G1-S期阻滞。六、Fnl4通过NF-κB通路调节SCLC的生长和耐药性1、Fn14对Bcl-xl蛋白具有调节作用,Western Blot结果显示：上调细胞中Fn14的表达显著增加了Bcl-xl蛋白的表达,Fn14表达下降,Bcl-xl蛋白水平显著降低。2、Fn14对NF-κB通路具有靶向调节作用将pNF-κB的荧光素酶载体及pRL-CMV empty Vector共转染各SCLC细胞株中,检测NF-KB荧光素酶活性显示,与对照组相比,上调Fn14的表达可显著增加H69,H446细胞中NF-κB的荧光素酶活性,下调Fn14的表达可显著降低H69AR, H446AR细胞中NF-κB的荧光素酶活性(P<0.05)。3、NF-κB信号通路在Fn14调控SCLC生长和耐药性的过程中起着重要的作用通过在H69-Fn14和H446-Fn14细胞中加或不加NF-κB通路抑制剂Celastrol,来验证NF-κB通路在Fn14调控SCLC生长和耐药性中的作用。结果显示：未加Celastrol组,上调Fn14的表达显著增加了Bcl-x1mRNA和蛋白的表达,继而促进SCLC的生长以及增加了细胞的耐药性；加入Celastrol组,抑制了NF-κB信号通路使得Fn14上调促进的Bcl-xl表达升高较对照组相比显著降低,继而进一步抑制了SCLC的生长并且增加了细胞对化疗药物的敏感性。七、Fn14在SCLC组织中的表达与临床病理特征的关系为了研究小细胞肺癌病人临床特征与Fn14表达的关系,我们通过免疫组化检测了51个SCLC病人肺肿瘤组织中Fn14的表达。结果发现：Fn14在肿瘤细胞的胞浆中表达,且Fn14在SCLC组织中的阳性表达率大概为51%。SCLC患者临床病理特征见表3-1。其中男性患者44例,女性患者7例；中位年龄为58岁,不超过58岁患者30例,58岁以上患者21例；局限期(LD)患者37例,广泛期患者14例。Fn14在男性患者中的阳性表达率为54.5%(24/44),在女性患者中的阳性表达率为28.6%(2/7),两者的Fn14阳性表达率无统计学差异(P=0.202)。Fn14在不超过58岁的患者中阳性表达率为50.0%(15/30),在58岁以上患者中阳性表达率为52.4%(11/21),两者的Fn14阳性表达率无统计学差异(P=0.867)。Fn14在局限期(LD)患者中的阳性表达率为48.0%(12/25),在广泛期患者中的阳性表达率为100.0%(14/14),两者的Fn14阳性表达率具有统计学差异(P<0.001)。采用Kaplan-Meier法及单变量方差分析：Fn14的表达与SCLC病人的生存率密切相关(P<0.001)。多变量方差分析SCLC临床病理特征与总生存率的关系：结果发现男性患者与女性患者的生存时间无统计学差异(P=-0.685)。不超过58岁的患者的生存时间显著高于58岁以上患者(P=0.520)。局限期患者的生存时间显著高于广泛期患者(P<0.001)。Fn14阳性表达患者的生存时间显著低于Fn14阴性表达患者(P=0.011<0.05)。结论1、SCLC多药耐药细胞株H69AR和H446AR中Fn14的表达显著高于其相应的敏感细胞株,增加或降低细胞中Fn14表达可以引起细胞增殖和耐药性的改变,表明Fn14参与了SCLC的生长及多药耐药。2、NF-κB信号通路通过影响其下游靶基因Bcl-xl的表达,在Fn14调控SCLC生长和耐药性的过程中起着重要的作用。3、Fn14在SCLC组织中的阳性表达与患者的分期和生存时间有关,有望成为SCLC患者的临床预后指标。