柑橘溃疡病(Citrus canker)是由革兰氏阳性的黄单胞菌致病亚种(Xanthomonas citri pv citri,Xcc)引起的最严重的柑橘细菌性病害。侵染柑橘叶片和果实后,造成叶片的枯萎和果实的脱落,对柑橘产业造成重大经济损失。目前,铜离子杀菌剂是国内外防治柑橘溃疡病的主要产品。但是,随着铜离子杀菌剂的长期使用不仅增加了细菌对铜离子的耐受性,还会造成生态环境污染。因此,寻找高效安全的新型杀菌剂替代传统的铜离子杀菌剂防控柑橘溃疡病的任务十分紧迫。小分子拟肽化合物通过模仿天然抗菌肽的两亲性结构,保留抗菌肽独特的膜活性作用机理而具有高效快速的杀菌活性,作为一种新型的潜在杀菌剂已引起研究者的广泛关注。天然二苯乙烯化合物是一类植物抵抗外界微生物的重要防御素,存在多种生物药理活性,常被作为新型药物分子的先导骨架。基于拟肽化合物两亲性结构和二苯乙烯的生物活性,设计、合成了一系列以二苯乙烯为疏水性核心的拟肽化合物。根据对柑橘溃疡病菌的体外活性数据,筛选出高活性化合物,测定其体内抗菌活性和生物膜抑制活性。进一步通过吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)活死细胞染色实验、细胞外膜通透性分析、260 nm处核酸物质泄露实验和扫描电子显微镜(SEM)细菌形貌观察研究二苯乙烯基拟肽化合物的作用机理。具体研究内容和结果如下:(1)以对三氟甲基苄溴和对甲酰基苯甲酸甲酯为起始原料,合成二苯乙烯化合物3作为拟肽合成的疏水性骨架。再以EDCI为缩合剂、HOBt为催化剂液相合成二苯乙烯基拟肽化合物。总共合成21个新的二苯乙烯基拟肽化合物,其中8个二苯乙烯基氨基酸化合物,9个二苯乙烯基二肽化合物,4个二苯乙烯基三肽化合物。目标化合物经核磁共振谱和高分辨率质谱进行结构鉴定。(2)采用微量肉汤稀释法测定二苯乙烯基拟肽化合物对柑橘溃疡病菌的最小抑菌浓度。结果表明,二苯乙烯基氨基酸化合物5a和6表现出较好的抗菌活性,MIC值为50μM;带两个正电荷的二苯乙烯基三肽化合物11c和11d表现出最高的抗菌活性,MIC值为25μM的;含两个连续疏水残基的二苯乙烯基拟肽化合物几乎没有抗菌活性,带一个正电荷的二苯乙烯基拟肽化合物表现出一定的抗菌活性,但是活性低于化合物5a和6。基于体外抗菌活性数据,在柑橘叶片上,测定了代表性化合物5a、6、11c和11d的体内抗菌活性。结果表明,化合物11c和11d对柑橘溃疡表现出明显的防治效果,叶片上几乎没有病变症状出现。此外,化合物11c和11d还表现出生物膜抑制活性,在50μM下,生物膜形成抑制率分别为77.8%和86.3%。(3)通过AO/EB活死细胞染色分析发现化合物6和11d在2×MIC浓度下不仅能快速杀灭细菌,而且能破坏细菌细胞膜结构。为了进一步研究二苯乙烯基拟肽作用于细胞膜的机理,测定了化合物6和11d对细胞外膜通透性、260 nm处核酸物质泄露和细菌形貌的影响。结果表明,测定化合物均表现出膜活性机理,并且化合物11d比化合物6具有更强的细胞膜破坏作用。即阳离子的二苯乙烯基拟肽与抗菌肽具有类似的作用机理,通过电相互作用与细胞膜静结合,诱导细胞外膜的破裂,影响细胞膜的通透性,造成细胞内容物的泄露,最终导致细胞裂解死亡。