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对比剂肾病（contrast induced nephropathy,CIN）是应用含碘对比剂后而出现的急性肾功能衰竭,已成为导致医源性急性肾衰竭发病仅次于肾灌注不足和使用肾毒性药物的第三位原因,有研究发现高糖环境下更容易诱发CIN,严重影响患者生活质量,虽然相关研究众多,但目前尚无有效治疗手段。多项研究发现对比剂急性肾损伤中肾小管上皮细胞中的mTOR和P70S6K去磷酸化失活现象增加,雷帕霉素是mTOR抑制剂,近年来研究发现mTOR与雷帕霉素和肾脏疾病具有密切的关系,参与了多种急慢性肾脏疾病的发生发展过程[1]。雷帕霉素能通过抑制mTOR增加自噬水平,缓解大鼠肾组织缺血再灌注损伤。但其是否能通过mTOR/p70S6K通路调控自噬以治疗糖尿病CIN大鼠方面的研究较少。基于以上,本研究采用股动脉注射碘克沙醇法建立CIN大鼠模型,观察雷帕霉素对糖尿病CIN大鼠肾功能的影响,探讨mTOR/p70S6K信号通路在其中的调控机制,为临床CIN预防及治疗提供新思路。1.不同粘度碘克沙醇在糖尿病大鼠肾损伤中的作用及自噬的介导作用目的:观察不同粘度碘克沙醇对糖尿病大鼠肾功能的影响,初步探讨其作用机制,为临床对比剂肾病防治提供实验理论依据。研究方法:SPF级SD大鼠90只,随机分为6个组:假手术组（Sham组）,270型碘克沙醇组（270’IO组）,320型碘克沙醇组（320’IO组）,糖尿病组（DM组）,糖尿病+270型碘克沙醇组（DM+270’IO组）,糖尿病+320型碘克沙醇组（DM+320’IO组）,采用腹腔注射链脲佐菌素（STZ）联合高脂饲料喂养建立糖尿病模型,采用股动脉给药法予以干预,分别观察各组大鼠尿液中肾损伤分子-1（KIM-1）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）含量;血中肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的浓度变化;HE染色观察肾脏病理学变化;TUNEL检测肾上皮细胞凋亡情况;Western blot法检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达。结果:与Sham组相比,各组大鼠Scr、BUN、KIM-1、NGAL、MDA的表达明显升高,SOD及GPX表达明显降低,且出现不同程度的病理性损伤及细胞凋亡情况,与DM组相比,270’IO组及320’IO组大鼠Scr、BUN、KIM-1、NGAL、MDA的表达有所升高,SOD及GPX表达有所降低,但差异不具有统计学意义（P>0.05）,病理学结果提示DM组、270’IO组及320’IO组大鼠肾小管上皮细胞破坏不明显,细胞排列基本规则,仅见少量肾小管细胞空泡变性及细胞凋亡,与DM组、270’IO组及320’IO组相比,DM+270’IO组及DM+320’IO组大鼠Scr、BUN、KIM-1、NGAL、MDA的表达明显升高,SOD及GPX表达明显降低（P<0.05）,病理学结果显示DM+270’IO组及DM+320’IO组大鼠肾小管上皮细胞破坏严重,可见肾小管空泡变性,细胞脱落至小管腔,肾小管结构破坏严重,肾小管上皮细胞凋亡明显。此外,高糖环境下,碘克沙醇显著下调LC3、Beclin 1蛋白的表达（P<0.05）,与DM组、270’IO组及320’IO组相比,差异显著,而与DM+320’IO组相比,DM+270’IO组对糖尿病大鼠损伤较轻。结论:等剂量下高粘度碘克沙醇对糖尿病大鼠肾功能损伤更明显,其作用机制可能与其抑制糖尿病大鼠肾脏自噬水平,促发氧化应激反应,诱导肾小管上皮细胞凋亡有关。2.雷帕霉素减轻碘克沙醇对糖尿病大鼠肾损伤及对自噬的调控作用目的:观察雷帕霉素对碘克沙醇所致糖尿病肾损伤大鼠肾功能影响及对自噬相关蛋白的调控作用,初步探讨其作用机制,为临床对比剂肾病防治提供理论依据。研究方法:SPF级SD大鼠45只,采用腹腔注射链脲佐菌素（STZ）联合高脂饲料喂养建立糖尿病模型,模型成功后,随机分为3组:糖尿病组（DM组）,糖尿病+320型碘克沙醇组（CM组）,糖尿病+320型碘克沙醇组+雷帕霉素（RAPA）,采用股动脉注射碘克沙醇法建立对比剂肾病动物模型,RAPA组予以雷帕霉素腹腔注射,余组予以等量25%DMSO溶液腹腔注射,观察各组大鼠血Scr、BUN表达情况,ELISA检测各组尿损伤标志物KIM-1、NGAL及氧化应激标志物SOD、MDA、GPX表达情况,HE染色及TUNEL染色观察病理学变化,免疫组化及Western blot观察自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达。结果:与DM组相比,CM组大鼠Scr、BUN、KIM-1、NGAL、MDA的表达明显升高,SOD及GPX表达明显降低（P<0.05）,肾小管上皮细胞破坏严重,可见肾小管空泡变性,细胞脱落至小管腔,肾小管结构破坏严重,肾小管上皮细胞凋亡明显,约占肾小管上皮细胞的32%（P<0.05）,经雷帕霉素干预后,RAPA组大鼠Scr、BUN、KIM-1、NGAL、MDA的表达明显降低,SOD及GPX表达明显升高（P<0.05）,病理学可见大鼠肾小管上皮细胞肿胀减轻,脱落减少,肾小球萎缩减轻,水肿充血减轻及炎性细胞浸润减轻,与CM组相比,RAPA组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况明显减轻,约占肾小管上皮细胞的18%（P<0.05）,此外雷帕霉素可以显著上调LC3、Beclin1的表达。结论:雷帕霉素可以显著减轻高糖环境下碘克沙醇所致大鼠肾功能损伤,其作用机制可能与其增加大鼠肾脏自噬水平,抑制氧化应激反应及细胞凋亡有关。3.雷帕霉素通过mTOR/P70S6K激活自噬抑制碘克沙醇所致糖尿病大鼠肾损伤目的:观察雷帕霉素对碘克沙醇所致糖尿病肾损伤大鼠肾mTOR/P70S6K通路的调控作用,初步探讨其对CIN大鼠自噬的调控机制,为临床防治对比剂肾病提供理论依据。研究方法:SPF级SD大鼠45只,采用腹腔注射链脲佐菌素（STZ）联合高脂饲料喂养建立糖尿病模型,模型成功后,随机分为3个组:糖尿病+320型碘克沙醇组（CM组）,糖尿病+320型碘克沙醇组+雷帕霉素（RAPA组）,糖尿病+320型碘克沙醇组+雷帕霉素+自噬抑制剂3-MA（3-MA组）,采用股动脉注射碘克沙醇法建立对比剂肾病动物模型,RAPA组予以雷帕霉素腹腔注射,3-MA组在RAPA组基础上于建模前2h腹腔注射自噬抑制剂,余组予以等量25%DMSO溶液腹腔注射,观察各组大鼠血Scr、BUN表达情况,ELISA检测各组尿损伤标志物KIM-1、NGAL及氧化应激标志物SOD、MDA、GPX表达情况,HE染色及TUNEL染色观察病理学变化,免疫组化及Western blot观察自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达及mTOR/P70S6K通路蛋白的调控作用。结果:与CM组相比,RAPA组Scr、BUN、KIM-1、NGAL、MDA的表达明显降低,SOD及GPX表达明显升高（P<0.05）,病理学可见大鼠肾小管上皮细胞肿胀减轻,脱落减少,肾小球萎缩减轻,水肿充血减轻及炎性细胞浸润减轻,与CM组相比,RAPA组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况明显减轻,约占肾小管上皮细胞的21%（P<0.05）,此外雷帕霉素可以显著上调LC3、Beclin1的表达（P<0.05）,抑制mTOR及p70S6K蛋白磷酸化（P<0.05）。而加入自噬抑制剂后,RAPA这种改善作用及调控机制明显被抑制。结论:雷帕霉素可以显著减轻高糖环境下碘克沙醇所致大鼠肾功能损伤,其作用机制可能与其调控mTOR/P70S6K信号通路,增加大鼠肾脏自噬水平,抑制氧化应激反应及细胞凋亡有关。