水稻CONSTANS-like基因OsCOL10作用于光周期开花途径的分子遗传与生化分析

来源 :湖南大学 | 被引量 : 7次 | 上传用户:qjesen
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水稻(Oryza sativa L.)是全球最重要的粮食作物之一。水稻开花时间(也叫抽穗期)是与其产量息息相关的农艺性状。适宜的开花时间不仅是水稻成功繁殖的必备条件,决定着水稻的播种时间以及播种范围,还是其高产稳产的一个重要指标。适当的抽穗期延迟,可以积累更多的营养物质,提高作物的产量。光周期是目前研究最多且影响水稻抽穗期最重要的环境因子之一。因此,光周期控制开花途径中相关基因的克隆及分子机理的研究,对构建水稻开花调控网络以及农业生产上适当改变抽穗期、提高作物产量具有重大理论和实践意义。CONSTANS(CO)是模式植物拟南芥光周期开花途径中最关键的基因。在水稻中,C ONSTANS-lik e(C OL)基因家族包含至少16个成员,目前该家族大部分成员的功能未知。本研究中,我们首先通过筛选水稻转录因子显性功能获得型突变体库(pubi::TFs-VP64),鉴定了一个参与水稻开花调控的COL基因并命名为OsCOL10;然后,构建OsCOL10过表达、干扰等转基因水稻株系并分析它们的表型以及比较各开花基因在转基因植株与野生型中的表达来确认OsCOL10在调控水稻开花中的角色;接着,我们对OsCOL10的基本特性进行了鉴定,包括它的进化分析,表达模式,亚细胞定位和转录激活活性分析等;通过比较OsCOL10在各开花突变体或近等基因系和相应野生型中的表达来明确OsCOL10调控光周期开花的机理以及它在水稻开花调控网络中的位置。最后,我们选取了具有地理分布代表性的100个水稻品种,对OsCOL10进行了单倍型分析。具体结果如下:(1)从转基因库中获得的两个独立的纯合转基因株系(OsCOL10-VP64-OX4和OsCOL10-VP64-OX7)在长短日照下相对野生型均表现晚开花,并伴有植株增高,穗子变大,产量提高等表型。为了研究延迟开花是否由生长过慢引起,我们同时调查了植株的出叶速率,结果发现转基因植株与野生型有着相似的出叶速率,说明转基因植株中延迟的开花表型不是由生长过慢而是成花诱导抑制引起。过表达OsCOL10(pubi::OsCOL10)在长短日照下出现类似的晚花表型,表明OsCOL10是水稻中组成型的开花抑制子。(2)通过比较水稻光周期开花相关基因在野生型和转基因植株之间的表达差异,发现OsCOL10负调控开花主要是通过抑制Ehd1从而抑制下游成花素基因Hd3a及RFT1的表达而实现的。(3)利用生物信息学手段,对拟南芥和水稻CO-like家族成员进行进化树分析,发现CO-like蛋白进化上可以划分为三个亚家族,其中OsCOL10属于第二组,该组中还未有成员被报导参与开花调控。OsCOL10包含一个位于N端的B-box锌指结构域和一个位于C端的CCT结构域。利用其氨基酸序列BLAST,发现它在其它禾本科植物中均有同源蛋白,然而这些蛋白功能均未知。(4)OsCOL10的表达在长短日照下都表现出以24小时为周期的昼夜节律,短日照下在清晨达到最高,长日照下在正午达到最高。另外,随着植株的发育,OsCOL10的表达先逐步增加,达到高峰后逐渐降低。我们把在12小时光照,12小时黑暗培养箱中培养28天的水稻,于黄昏时移至连续光照(LL)和连续黑暗(DD)条件处理4天。当移动至LL或者DD条件下,尽管OsCOL10的表达有所下降,但是仍然具有节律性,说明OsCOL10受节律钟调控。(5)实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测OsCOL10在水稻各个组织中的表达,结果发现,除了根部检测不到其表达外,其它组织都能检测到OsCOL10的表达,并且其在叶片中的表达量最高。p OsCOL10::GUS植株染色得到相似的结果,切片观察还发现GUS信号主要分布在维管束的外围。用OsCOL10特异性的探针对叶片的石蜡切片进行原位杂交实验,进一步证明杂交信号主要集中于维管束外围的叶肉细胞中。(6)OsCOL10是一个转录因子。基因枪介导的瞬时表达显示OsCOL10定位于洋葱表皮细胞的细胞核中。在Ubiquitin(UBI)启动子启动的OsCOL10-GFP转基因水稻根中,我们可以清楚的看到OsCOL10定位于细胞核中。转录自激活分析表明,OsC O L10具有微弱的转录自激活活性,并且B-box锌指与C C T结构域之间的中间区域对于OsCOL10转录激活活性是必需的。这些结果表明OsCOL10在调控细胞核基因表达中起重要作用。(7)通过比较OsCOL10在不同的开花突变体或者近等基因系与相应的野生型间的表达差异,发现长日照下OsCOL10在NIL(Ghd7)中的表达要高于NIL(ghd7)。我们进一步把有功能的Ghd7在自身启动子的驱动下导入Ghd7缺失功能的受体K itaake中,转基因阳性植株抽穗期延迟,并且OsCOL10的表达量在转基因植株中显著升高。表明OsCOL10长日照下受Ghd7调控。(8)选取具有地理分布代表性的100个水稻品种,对OsCOL10进行了单倍型分析。发现OsCOL10在水稻种属中非常保守,其中Hap3代表了主要的单倍型。
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